实验纤维素酶活力的测定（35二硝基水酸法）
一、实验目的
掌握还原糖的测定原理，学习用35二硝基水酸法测定纤维素酶活力的法。
二、实验原理
纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将35二硝基水酸中的硝基
还原成橙黄色的氨基化合物，故可利用比色法测定其还原物生成量来表示纤维素酶的活力。
三、主要仪器与试剂
一实验仪器
125mL比色管2722型分光光度计3滴管4水浴锅5移液枪6电炉
二、试剂
135二硝基水酸显色液：称取100g35二硝基水酸，溶入200mL蒸馏水中，加
入20g分析纯氢氧化钠，200g酒酸钾钠，加水至500mL，升温溶解后，加入重蒸苯酚20g，
无水亚硫酸钠050g。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000mL。存于棕色瓶中，放置一
后使用。
201molLpH45乙酸乙酸钠缓冲溶液。
305羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。使用前摇匀。
4葡萄糖标准溶液：称取干燥至恒重的无水葡萄糖100mg，溶解后定容至100mL，此
溶液含葡萄糖100mgmL。
5纤维素酶液：将005g酶溶解定容至50mL，从中取出10mL再定容至100mL，待
检测用。（用pH45乙酸乙酸钠缓冲溶液配制）
四、实验步骤
1标准曲线的绘制：分别吸取00，020，040，060，080，100mL葡萄糖标准液
于6支25mL比色管中，均用蒸馏水稀释至1mL，加35二硝基水酸显色剂3mL，在沸水
浴中煮沸显色10mi
，冷却，加蒸馏水21mL，摇匀。以空白管调零，在550
m处比色。
以光密度为纵坐标，以葡萄糖μg数为横坐标，绘出标准曲线。
序号
1
2
3
4
5
6
葡萄糖标液
00020
040
060
080
100
蒸馏水
10080
060
040
020
00
35二硝基水酸30
30
30
30
30
30
实验操作
沸水浴加热10mi
，冷却后，加水定容，摇匀，比色测定
吸光度A550
m
00
2空白管的测定：在2支25mL试管中各加入10mL酶液，沸水浴5mi
，冷却后加
30mL05CMCNa，与样品管同时放入50℃水浴30mi
。其它操作同样品管。
3样品的测定：在3支25mL试管中各加入05羧甲基纤维素钠溶液30mL，酶液
10mL，于50℃水浴中糖化30mi
，取出，立即于沸水浴中煮沸10mi
使酶失活，得糖化
液，冷却加入30mL35二硝基水酸显色液，再沸水浴10mi
，冷却后加水定容至25mL，
混匀，以空白管调零，在550
m处测OD值，查葡萄糖标准曲线得样品的葡萄糖μg数。
五、结果计算
在上述条件下，1酶每分钟催化纤维素水解生成1微克葡萄糖定为一个活力单位。
纤维素酶活力单位（μgmgmi
）NOD值对应的葡萄糖量g＝301
式中：N酶液的稀释倍数，此r