实验纤维素酶活力的测定(35二硝基水杨酸法)
一、实验目的掌握还原糖的测定原理,学习用35二硝基水杨酸法测定纤维素酶活力的方法。
二、实验原理纤维素酶水解纤维素,产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖,能将35二硝基水杨酸中的硝
基还原成橙黄色的氨基化合物,故可利用比色法测定其还原物生成量来表示纤维素酶的活力。三、主要仪器与试剂
一实验仪器125mL比色管2722型分光光度计3滴管4水浴锅5移液枪6电炉二、试剂135二硝基水杨酸显色液:称取100g35二硝基水杨酸,溶入200mL蒸馏水中,加入20g分析纯氢氧化钠,200g酒石酸钾钠,加水至500mL,升温溶解后,加入重蒸苯酚20g,无水亚硫酸钠050g。加热搅拌,待全溶后冷却,定容至1000mL。存于棕色瓶中,放置一周后使用。201molLpH45乙酸乙酸钠缓冲溶液。305羧甲基纤维素钠水溶液,溶解后成胶状液,静置过夜。使用前摇匀。4葡萄糖标准溶液:称取干燥至恒重的无水葡萄糖100mg,溶解后定容至100mL,此溶液含葡萄糖100mgmL。5纤维素酶液:将005g酶溶解定容至50mL,从中取出10mL再定容至100mL,待检测用。(用pH45乙酸乙酸钠缓冲溶液配制)四、实验步骤1标准曲线的绘制:分别吸取00,020,040,060,080,100mL葡萄糖标准液于6支25mL比色管中,均用蒸馏水稀释至1mL,加35二硝基水杨酸显色剂3mL,在沸水浴中煮沸显色10mi
,冷却,加蒸馏水21mL,摇匀。以空白管调零,在550
m处比色。以光密度为纵坐标,以葡萄糖μg数为横坐标,绘出标准曲线。
序号葡萄糖标液
蒸馏水35二硝基水杨酸
实验操作吸光度A550
m
1
2
3
4
5
6
00
020
040
060
080
100
10
080
060
040
020
00
30
30
30
30
30
30
沸水浴加热10mi
,冷却后,加水定容,摇匀,比色测定
00
2空白管的测定:在2支25mL试管中各加入10mL酶液,沸水浴5mi
,冷却后加30mL05CMCNa,与样品管同时放入50℃水浴30mi
。其它操作同样品管。
3样品的测定:在3支25mL试管中各加入05羧甲基纤维素钠溶液30mL,酶液10mL,于50℃水浴中糖化30mi
,取出,立即于沸水浴中煮沸10mi
使酶失活,得糖化液,冷却加入30mL35二硝基水杨酸显色液,再沸水浴10mi
,冷却后加水定容至25mL,混匀,以空白管调零,在550
m处测OD值,查葡萄糖标准曲线得样品的葡萄糖μg数。
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f五、结果计算在上述条件下,1酶每分钟催化纤维素水解生成1微克葡萄糖定为一个活力单位。
纤维素酶活力单位(μgmgmi
)=NOD值对应的葡萄糖量g301
式中:N酶液的稀释倍r