一、蛋白质的样品制备
一、溶液
裂解液及蛋白酶抑制剂每毫升裂解液加20ulcocktail
二、操作步骤
1、6孔板置于冰上细胞经预冷的PBS漂洗3次每孔加入100μl裂解液5mi
后用细胞刮刀刮取细胞用枪头转移至15mlEP管中编号置于冰上。
2、以上所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理超声时间为3S间歇时间为10S重复三次。
3、于4℃离心机预冷12000r离心15mi
取上清收集于05mlEP管中。
二、蛋白浓度的测定BCA法测定蛋白浓度
1取标准蛋白2mgml备用。
2于标准蛋白稀释为2mgml1mgml05mgml025mgml0125mgml0mgml96孔板中每孔加入10ul设3个复孔待测蛋白稀释8倍每孔加入10ul设3个复孔每孔加入BCA工作液A液B液501混匀90ul37℃温浴30mi
酶标仪测出各吸光度值EXCEL输入数据绘制标准曲线。测出待测蛋白浓度。测完蛋白含量后计算含30、50μl蛋白的溶液体积即为上样量。按上样量取出样品至05ml的EP管中加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×。后蛋白于95℃煮5mi
干湿温箱预热。样品于80℃保存。
三、电泳
1制胶
分离胶
电泳凝胶浓度
试剂10
H2Oml40
30丙烯酰胺33
15mollTrisclPH88ml
25
10SDSml01
10APml01
TEMEDμl5
总体积ml10
浓缩胶
试剂浓度5
H2Oml2
f30丙烯酰胺T30C3ml05
10mollTrisclPH88ml05
10SDSμl40
10APμl30
TEMEDμl4
总体积ml3
1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。
2、按前面方法配10分离胶加入TEMED前混匀加入TEMED后再次摇匀即可灌胶。灌胶时可用1ml枪吸取胶沿玻璃放出待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层水。
3、当水和胶之间有一条折射线时说明胶已凝了时间约20mi
左右。用吸水纸将胶上面水吸干。
4浓缩胶按前面比例加入加入TEMED前混匀加入TEMED后再次摇匀快速灌胶可用1ml枪吸取胶沿玻璃放出约5mi
后浓缩胶凝固插梳子时要使梳子保持水平。放入4℃冰箱备用。
2、电泳
1配制电泳缓冲液5×Tris15g甘氨酸72gSDS5gH2O至1L稀释为1×
2取出胶板两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。加足够的电泳液后开始准备上样。电泳液至少要漫过内侧的电泳槽外侧量可只到23。用枪头吸取样品将样品吸出不要吸进气泡。将枪头稍插入孔中缓慢加入样品。
3、加样完毕于冰上电泳盖好电泳槽的盖子注意电极方向红对红黑对黑先以80V电压进行电泳1520mi
左右后调电压至100V电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处即停止电泳时间约1h30mi
左右注意观察电泳液是否泄漏。
四、转膜
1配制转膜缓冲液5×Tris15g甘氨酸72g加水定容到1L稀释为1×放入4℃预冷。
2将PVr