Wester
Blot实验技术一、制胶
SDSPAGE分离胶配方表
1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口15mL停止加胶。3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。
f二、上样
1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。4、上样时从左到右依次上样。5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。6、要预留Marker的上样孔。
三、电泳
四、转膜
PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvi
ylide
efluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
f（转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。）1、转印滤纸：全胶长85cm，宽55cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。3、PVDF膜：剪裁85cm55cm，需在甲醇中浸润2mi
（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。
三明治夹心法：负极（黑）海绵垫滤纸胶PVDF膜滤纸海绵垫正极（白）
转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。
装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。装置运行时需冰浴。）
五、封闭
f在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。
封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5BSA，10脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐
o
fatmilk封闭）。1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST脱脂奶粉20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5BSA效果更好）倒好。2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。3、封膜一般常温12小时即可，也可4℃封闭过夜。
六、一抗
抗体反应主要采用间接法即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二
抗物质有放射性核素，酶，以及生物素等。1、将封闭后的杂交膜，在摇床上用TBST洗膜3次×5mi
，2、加入经TBST稀释的一抗（用血清封闭液）3、4℃孵育过夜或室温摇动孵育24小时回r