DF膜在甲醇中活化。在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、滤纸和浸过的膜。
3将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫在垫子上垫一层加厚滤纸注意不要有气泡。
4要先将玻璃板撬掉才可剥胶撬的时候动作要轻要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动直到撬去玻板。除去小玻璃板后将浓缩胶轻轻刮去要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上要盖满整个胶膜盖下后不可再移动并除气泡。在膜上盖1张加厚滤纸并除去气泡。最后盖上海绵合起夹子。整个操作在转移液中进行要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触接触后会发生短路。5先开启4℃循环冷凝水预冷将夹子放入转移槽中要使夹的黑面对槽的黑面夹的白面对槽的红面。电转移时会产热加冰降温。以250mA转膜3h。
五、丽春红染色
f转完膜后用TBST浸润一下将膜用1×丽春红染液染5mi
于脱色摇床上摇。然后用TBST冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。再以TBST彻底洗去丽春红染液。
六、封闭
以5的脱脂牛奶粉溶于TBST中将膜放入封闭液中封闭1h。
七、抗体孵育
1、标记Marker分子量选择目的蛋白所在范围剪膜将条带在一抗参照说明书比例VP1611000ICP41500及内参参照说明书中孵育封闭于PE手套中注意不要有气泡加入约2ml封闭液后摇床上4℃过夜。
2取出一抗及内参中的条带用TBST在水平摇床中洗脱4次每次5mi
。加TBST10ml于50ml离心管中加入相应二抗注意羊抗兔还是羊抗鼠相应条带放入其中若为两条则背靠背放置于摇床中孵育1h。
3离心管中取出条带置于TBST中洗脱3次每次10mi
。
八、显影
于条带上加化学发光ECL比例为11放置时间不可过长显影。
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