细胞冻存、解冻方法与细胞计数
一、细胞冷冻保存
1材料：生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSOSigmaD2650、无菌塑料冷冻保存管Nalge
e50000020、04％（wv）trypa
blueGibcoBRL15250061、血球计数盘与盖玻片、等速降温机KRYO10SeriesII2、冷冻保存方法：（1）传统方法冷存管置于4℃10分钟20℃30分钟80℃16～18小时或隔夜液氮槽vaporphase长期储存。20℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以1～3℃分钟之速度由室温降至（80℃以下）120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。3、步骤：（1）冷冻前2448小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。（2）配制冷冻保存溶液使用前配制：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜（DMSO）至20浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。（3）离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液约01ml计数细胞浓度及冻前存活率。（4）取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为5～10％），使细胞浓度为1～5×106cellsml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2mlvial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。4、注意事项：（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好logphase且存活率高之状态，约为80～90％致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。（2）细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在70度可保存数月。（3）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色以022micro
FGLPTelflo
过滤或是直接购买无菌产品，如SigmaD2650，以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10甘油冻存。（4）冷冻保存之细胞浓度：①
ormalhuma
fibroblast1～3×106cellsml②hybridoma1～3×106cellsml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻r