一、细胞复苏
（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10的FBS高糖DMEM，青链霉素DHa
ks溶液放在37℃水浴锅中预热备用。（2）快速从液氮罐中取出细胞冻存管，即刻放入37℃水浴锅中解冻，1000rmi
离心5分钟。（3）吸取弃去上清液，在冻存管中加入培养基混悬细胞，移液器转移至细胞培养皿中，反复两次用培养液清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。（4）加入足量的培养液，放在CO2培养箱中细胞培养，第二天换液。
二、细胞冻存
（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10的FBS高糖DMEM，青链霉素DHa
ks溶液，DMSO放在37℃水浴锅中预热备用。生长状态良好的细胞铺满培养瓶底的约80时，换液后12～24h换液培养。吸去培养液，DHa
ks溶液冲洗瓶底一次再吸弃。加入025％胰酶到培养瓶，覆盖瓶底，来回转动培养瓶，观察等待细胞消化至多数细胞形状变圆或从瓶底脱落下来。（2）加入5ml含血清的培养液中止消化。反复吸取瓶内培养液吹打细胞，形成细胞悬液。进行细胞计数，细胞悬液移植15ml离心管中，3500rmi
离心5mi
。（3）静置吸弃上清液，然后加入冻存液（73DMEM培养液，20％FBS，最后添加7％DMSO二甲基亚砜），细胞计数达到2×106ml以上。细胞混匀后加入冻存管中，每管1ml。注明细胞种类、代数、冻存时间、名字，检查密封性。降温程序：冷冻管置于4℃10分钟→80℃16～18小时（或隔夜）→液氮槽（196℃）长期储存。
f三、细胞传代
（1）提前20分钟打开生物安全柜紫外灯消毒待用；10的FBS高糖DMEM，青链霉素DHa
ks溶液放在37℃水浴锅中预热备用。当细胞长满培养瓶底的约80时，吸弃原先的培养液。（2）加DHa
ks溶液洗涤一次瓶底，吸弃。加入025％胰酶到培养瓶，覆盖瓶底，来回转动培养瓶，观察等待细胞消化至多数细胞形状变圆或从瓶底脱落下来。（3）加入5ml含血清的培养液中止消化。反复吸取瓶内培养液吹打细胞，形成细胞悬液。进行细胞计数，根据实验需要将适量单细胞悬液转至培养瓶或孔板中。（4）置37℃、5CO2的培养箱内继续培养。第二天观察贴壁生长情况。（5）将细胞按1×106mL接种于培养皿，培养脐静脉内皮细胞时加入含10胎牛血清的M199培养基，内含谷氨酰胺10gL、维生素C10gL和双抗100UmL。常规培养，23天换一次液，显微镜下观察细胞形态、生长状况等。通常情况下，HUVECs在培养2至3天后可传代，传代时可根据细胞计数结果来确定传代比例。本次实验用到的HUVECs均在第2代和第5代之间，未超过5代。因为r