TUNELTdTmediateddUTPNickE
dLabeli
g法检测细胞凋亡实验原理和方法
原理：细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50300kb的大片段。然后大约30的染色体DNA在Ca和Mg依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’OH形成，很少能够被染色。
实验方法TUNEL检测对于贴壁细胞或细胞涂片aPBS或HBSS洗涤一次。b如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。c用4多聚甲醛或碧云天生产的免疫染色固定液P0098固定细胞3060分钟。d用PBS或HBSS洗涤一次。e加入含01Trito
X100的PBS，冰浴孵育2分钟。f转步骤5。
TUNEL检测对于悬浮细胞或细胞悬液a收集细胞不超过200万细胞，PBS或HBSS洗涤一次。b用4多聚甲醛固定细胞3060分钟。为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。c用PBS或HBSS洗涤一次。d用含01Trito
X100的PBS重悬细胞，冰浴孵育2分钟。e转步骤5。
TUNEL检测对于石蜡切片a二甲苯中脱蜡510分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡510分钟。无水乙醇5分钟。90乙醇2分钟。70乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。b滴加20μgml不含DNase的蛋白酶K，2037℃作用1530分钟不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索。cPBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。d转步骤5。
TUNEL检测对于冷冻切片a用4多聚甲醛固定细胞3060分钟。bPBS或HBSS洗涤2次，每次10分钟。c加入含01Trito
X100的PBS，冰浴孵育2分钟。d转步骤5。
fTUNEL检测配制TUNEL检测液参考下表配制适当量的TUNEL检测液，需充分混匀。注意：配制好的TUNEL检测液必须一次使用完毕，不能冻存。
1个样品5个样品10个样品
TdT酶
2μl
荧光标记液
48μl
TUNEL检测液50μl
10μl240μl250μl
20μl480μl500μl
TUNEL检测对于贴壁细胞、细胞涂片或组织切片a用PBS或HBSS洗涤2次。b在样品上加50μlTUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟r