采用手工洗板，则可在每次弃去板孔内液体后将反应板于布料上拍干，布料可在消毒洗涤后重复使用。
手工洗板一般为3～5次，使用洗板机洗板时，其所需次数可通过以下实验确定：选择8×12HBsAgELISA包被板条，在每孔中平行加入相同的一份弱阳性血清，按试剂盒说明加入酶结合物并完成温育，洗板机设置如下：第1次洗涤1排、第2次洗涤2排、第3次洗涤3排……直至8次洗涤8排，每次只洗涤1遍，其结果是第1排洗涤了8遍，第2排洗涤7遍……第8排洗涤1遍，加底物显色后，根据吸光度值不再改变的反应条的洗涤次数来确定最佳的洗板次数，例如第3排反应条吸光度值不再改变，则认为该项目最佳洗涤条件为6遍。另外需要注意的是对于两步法而言第一步洗涤次数不宜太多，否则将降低结果的吸光度值。44显色
显色是ELISA中的最后一步温育反应，在以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中，主要采用TMB和OPD两种底物，其中以TMB最为多见，TMB底物显色一般要求室温或37℃反应15～30分钟。研究表明，显色受时间和温度的影响，一般37℃反应30分钟可使显色充分，如果缩短反应时间或者降低反应温度均可影响检测的下限。TMB显色体系的A液和B液可在使用前先混合然后用排枪加入反应孔中，这样既节省人力又缩短了操作时差对结果的影响。反应液应新鲜配制并且避免接触金属器皿，否则可因氧化等原因产生颜色反应。OPD由于其具有致癌性目前已很少使用。45比色
ELISA显色的结果必须通过酶标仪进行检测，有两个重要的原因：一是不同观测者的色觉存在差异，如果仅凭肉眼判断，则结果重复性差，并且难以形成统一的判断标准，尤其是对于HBeAb、HBcAb这样的检测项目；二是《管理办法》要求实验室必须对ELISA检测的原始吸光度值，阴阳性判断结果等数据进行保存。
TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止，各类酸性终止液则将蓝色转变成黄色。有实验表明，从终止反应后2分钟开始，样本的吸光
f度值逐渐下降，起始吸光度值越高其下降速度越快，为保证实验结果的稳定性，宜在终止反应后2分钟内读取吸光度值。
酶标仪应采用双波长进行测定，包括对颜色产物敏感和不敏感的两个吸收峰波长，在非敏感波长处测定特异性显色的吸光度值接近为零，此时测的吸光度值为容器上的划痕、指印、背景等造成的光干扰。以TMB底物为例，其最大吸收的波长为450
m，非敏感波长为630
m，双波长检测最终得到的吸光度值为两者之差。双波长测定能去除背景的干扰，一般不设r