异性吸附。需要稀释的项目必须考虑到稀释方法对结果的影响，可采用振荡器混匀。42温育
在ELISA检测中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育i
cubatio
。
温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的温育温度，也是大多数抗原抗体结合的最适反应温度。有实验表明，抗原抗体反应一般在37℃经1～2小时产物的生成可达顶峰。为加速反应，可在一定范围内提高反应的温度并在反应过程中连续振荡以增加抗原抗体接触的机会。抗原抗体反应在4℃环境中更为彻底，形成的产物更多更稳定，但因所需时间太长，在ELISA检测中一般不予采用。
温育的方式有温箱法、微波辐射法、水浴法等，其中水浴法能较好解决因受热不均衡所致的周围孔与中央孔的吸光度差异（这种现象被称为“边缘效应”）。若用温箱温育则ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。采用这种温育方式的关键是必须保证湿盒内的温度达到反应的要求，可在反应前将湿盒预温至规定的温度，并用温度计监测反应过程。采用水浴时，将ELISA板置于水浴箱中，板底贴着水面。为避免蒸发，板上应加盖或用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。温育过程中，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。微波辐射法能缩短温育时间，但不能解决“边缘效应”，因而较少使用。43洗涤
洗涤是ELISA测定过程中决定实验成败的一个关键步骤。其目的是去除反应体系中与反应无关的成分、未结合的酶结合物以及反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。由于抗原和抗体的包被通常是在碱性条件下与固相的疏水键相互作用而被动吸附于其上的，因此必须注意非离子去垢剂的使用浓度，最常用的洗涤液是含005％吐温20的002molL，pH为74的PBS液，如果洗涤液中的吐温20超过02％，可使包被于固相上的抗原或抗体解
f吸附而影响实验的测定下限。洗涤可采用洗板机或手工洗涤两种方式，手工洗板则分为浸泡式和流水冲洗式洗涤。无
论洗板方式如何，在向板孔内注液时应当避免气泡残留孔内，否则会因洗涤液难以进入孔中而影响洗涤效果。在采用洗板机洗板时，一定要将板条平放于板架上，保证洗板机上的每个吸液针都能一致地插入板孔底部将洗液完全吸净，否则空白值将升高甚至出现“花板”现象（背景不干净），造成实验失败。若r