定的三维结构,所以大部分蛋白质仍能较好的溶解在水溶液中。在一定的离子强度范围内,溶液中的小分子离子在静电作用下吸附包裹在蛋白质表面亲水基团外侧,形成双电层结构,一定程度上有助于稳定蛋白结构及其水溶性。但蛋白质在不同的pH条件下,其带电状况不同。当pH较低时,蛋白质表面正电荷多于负电荷,总体电性为正;当pH较高时,蛋白质表面正电荷少于负电荷,总体电性为负;当蛋白质表面正电荷量与负电荷量相当时,蛋白质总体显示电中性,双点层结构解体,蛋白质亲水性降到最低,将表现出明显的疏水性,发生疏水性团聚和沉淀,此时的pH值即为蛋白质的等电点。不同蛋白质结构不同,等电点亦不同,但大部分已知蛋白多属于阴离子蛋白,在中性溶液中显示出电负性。离子交换层析可以用于蛋白质的分离纯化:阴离子交换基质能吸附带有负电荷的蛋白质,阳离子交换基质能结合带有正电荷的蛋白质。一般而言,pH越低,蛋白质净正电荷数越多,pH越高,蛋白质净负电荷数越多;蛋白质分子个头越小,净电荷数越多,离子交换吸附作用越强,越难被洗脱;溶液中小分子离子含
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f量越多,蛋白质可吸附量越少,但若小分子离子含量过低,蛋白质双电层结构不易形成,其水溶性会降低。因此,可以通过提高洗脱液中的盐浓度或改变pH值等措施,将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。2离子交换层析分离蛋白质的过程与步骤本实验将采用强碱性大孔树脂吸附分离牛血清白蛋白(BSA),实验装置结构如图所示。离子交换层析操作一般分为五步:(1)平衡:用操作条件下的背景缓冲液平衡层析柱,使介质柱中溶液环境体系各处均一,与吸附上样样品的背景溶液条件相同;(2)上样:将待分离原料连续稳定的注入层析柱中进行吸附分离,未被吸附的物料将从层析柱下端排出;随上样时间的增加,层析介质的吸附量将逐渐增大并趋于饱和,出口浓度也将不断增加直至与上样浓度相同。待吸附上样物料未被吸附而从出口排出,称为穿透。(3)冲洗:用背景缓冲液冲洗层析系统,排出管路及层析柱床空隙中未吸附的物料;若在该溶液环境条件下原料与吸附介质间的吸附作用力较弱,则冲洗操作会造成部分解吸。(4)洗脱:用特定pH值的含盐缓冲液冲洗层析柱,解吸柱内的蛋白质;(5)再生:用再生溶液冲洗层析柱,彻底清除未解吸的吸附物料,再生还原层析介质,以备后用。3物料恒算若收集上样和冲洗过程的穿透液,根据物料守恒,应有:上样量穿透量吸附量若上样浓度为C0,上样r