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stro
e,E1)、已烯雌酚Diethylstilbestrol,DES、邻苯二甲酸二甲酯(dimethylphthalate,DMP)、壬基酚(No
ylphe
ol,NP)、ERα、十二烷基硫酸钠SDS、鲑鱼精DNA购自美国sigma公司,Dy
alMPCS磁力架、羊抗兔IgG包被的Dy
albeadsM280免疫磁珠购自I
vitroge
公司,兔源a
tiphosphoERαSer167购自Sa
taCruz公司,Tris、EDTA、糖原、牛血清白蛋白BSA、蛋白酶K等购自Roche公司,酪蛋白激酶II(Casei
csrcKi
aseII,CKII购自Calbiochem公司,酪氨酸激酶p60购自MilliporeUpstate公司,GoldTaqDNA聚合酶、含有AmpliTaqGoldDNAPolymerase的荧光定量预混master购自美国ABI公司;其他为国产试剂,购自北京鼎国生物公司。结合缓冲液、洗涤液等的配置参考文献59进行,试剂使用参照说明书进行。12结合探针筛选和检测探针的设计参照文献10,从Ge
eBa
k中找到40余条含有全臂或半臂雌激素受体反应元件(ERE)的基因,并从中筛选出两条与ERα亲和力高的序列作为结合探针,其中一条为人源性的细胞色素c氧化酶Ⅶa亚单位相关蛋白基因(huma
cytochromecoxidasesubu
itⅦarelatedprotei
,COX7RP),另一条为来源于非洲爪蟾的卵黄蛋白原A2基因(Xe
opuslaevisvitelloge
i
A2,VitA2),均含有全臂ERE核心序列5’GGTCA

TGACC3’(
为任意核苷酸),取COX7RP基因ERE核心序列左右共89bp的核苷酸以及VitA2基因ERE核心序列左右共105bp的序列核苷酸进行基因合成,合成由北京奥科生物公司完成,测序验证并测定浓度后,20℃冻存做结合探针用;针对筛选的结合探针,采用ABIPrimerEexpress20软件设计了相应的MGBTaqMa
检测探针和引物,其报告基团为FAM标记的蓝色荧光基团,淬灭基团为不发荧光的MGB基团,由上海基康公司合成。序列见表1。
f表1结合探针及检测探针序列名称
COX7RPERE
序列5’→3’
GTCTGGCCTGGCGTGGAAGTTTGGTCTGGCTCACTGCAGAGGTCAaggTGACCCACGTAGTCACTTGTCTAAAAGGGATGGTTTGTGTG
特征
89bp
COX7RPFPCOX7RPRPCOX7RPMGBVitA2ERE
TGGCCTGGCGTGGAAGTACAAACCATCCCTTTTAGACAAGTGFAMTGGTCTGGCTCACTGCQMGBAATAGTTTTCTGCATAGCCTCTTTGATTAGATTAACTGTCCAAAGTCAGGTCA
17bpTm598℃25bpTm586℃16bpTm693℃105bp
cagTGACCTGATCAAAGTTAATGTAACCTCAACCTGGACAAAGCTACTAGTT
VitA2FPVitA2RPVitA2MGBCTGCATAGCCTCTTTGATTAGATTAACTGTGCTTTGTCCAGGTTGAGGTTACATTFAMTCACAGTGACCTGATCAAAQMGB30bpTm575℃25bpTm589℃19bpTm676℃
注:下划线为ERE核心序列5’GGTCA

TGACC3’(
为任意核苷酸)
13ERα体外受体配体特异结合用含5gLBSA和1mgml鲑鱼精DNA的PBS封闭包被有羊抗兔IgG的免疫磁株,4℃30rpm轻摇12h,以减少非特异性吸附。用Dy
alMPCS磁力架收集r
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