stro
e，E1）、已烯雌酚Diethylstilbestrol，DES、邻苯二甲酸二甲酯（dimethylphthalate，DMP）、壬基酚（No
ylphe
ol，NP）、ERα、十二烷基硫酸钠SDS、鲑鱼精DNA购自美国sigma公司，Dy
alMPCS磁力架、羊抗兔IgG包被的Dy
albeadsM280免疫磁珠购自I
vitroge
公司，兔源a
tiphosphoERαSer167购自Sa
taCruz公司，Tris、EDTA、糖原、牛血清白蛋白BSA、蛋白酶K等购自Roche公司，酪蛋白激酶II（Casei
csrcKi
aseII，CKII购自Calbiochem公司，酪氨酸激酶p60购自MilliporeUpstate公司，GoldTaqDNA聚合酶、含有AmpliTaqGoldDNAPolymerase的荧光定量预混master购自美国ABI公司；其他为国产试剂，购自北京鼎国生物公司。结合缓冲液、洗涤液等的配置参考文献59进行，试剂使用参照说明书进行。12结合探针筛选和检测探针的设计参照文献10，从Ge
eBa
k中找到40余条含有全臂或半臂雌激素受体反应元件（ERE）的基因，并从中筛选出两条与ERα亲和力高的序列作为结合探针，其中一条为人源性的细胞色素c氧化酶Ⅶa亚单位相关蛋白基因（huma
cytochromecoxidasesubu
itⅦarelatedprotei
，COX7RP），另一条为来源于非洲爪蟾的卵黄蛋白原A2基因（Xe
opuslaevisvitelloge
i
A2，VitA2），均含有全臂ERE核心序列5’GGTCA

TGACC3’（
为任意核苷酸），取COX7RP基因ERE核心序列左右共89bp的核苷酸以及VitA2基因ERE核心序列左右共105bp的序列核苷酸进行基因合成，合成由北京奥科生物公司完成，测序验证并测定浓度后，20℃冻存做结合探针用；针对筛选的结合探针，采用ABIPrimerEexpress20软件设计了相应的MGBTaqMa
检测探针和引物，其报告基团为FAM标记的蓝色荧光基团，淬灭基团为不发荧光的MGB基团，由上海基康公司合成。序列见表1。
f表1结合探针及检测探针序列名称
COX7RPERE
序列5’→3’
GTCTGGCCTGGCGTGGAAGTTTGGTCTGGCTCACTGCAGAGGTCAaggTGACCCACGTAGTCACTTGTCTAAAAGGGATGGTTTGTGTG
特征
89bp
COX7RPFPCOX7RPRPCOX7RPMGBVitA2ERE
TGGCCTGGCGTGGAAGTACAAACCATCCCTTTTAGACAAGTGFAMTGGTCTGGCTCACTGCQMGBAATAGTTTTCTGCATAGCCTCTTTGATTAGATTAACTGTCCAAAGTCAGGTCA
17bpTm598℃25bpTm586℃16bpTm693℃105bp
cagTGACCTGATCAAAGTTAATGTAACCTCAACCTGGACAAAGCTACTAGTT
VitA2FPVitA2RPVitA2MGBCTGCATAGCCTCTTTGATTAGATTAACTGTGCTTTGTCCAGGTTGAGGTTACATTFAMTCACAGTGACCTGATCAAAQMGB30bpTm575℃25bpTm589℃19bpTm676℃
注：下划线为ERE核心序列5’GGTCA

TGACC3’（
为任意核苷酸）
13ERα体外受体配体特异结合用含5gLBSA和1mgml鲑鱼精DNA的PBS封闭包被有羊抗兔IgG的免疫磁株，4℃30rpm轻摇12h，以减少非特异性吸附。用Dy
alMPCS磁力架收集r