磁珠，PBS洗涤3次。将1300稀释的兔源a
tiphosphoERαSer167与封闭后的免疫磁珠于室温轻摇3h，形成磁珠二抗pERαSer167固相载体。磁力架收集磁珠固相载体，洗涤3次，备用。终浓度为1
M的ERα20μL与20μL系列浓度的雌激素（E1、E2、DES和DMP终浓度从10×101410×106M；NP从10×101410×103M）在结合缓冲液中4℃孵育1h；加入ERαSer167特异性磷酸化酶CKⅡmix20μL，37℃孵育20mi
，加csrc1μLERαTyr537特异性磷酸化酶p60（1uμL）催化15mi
，促进ERα二聚体化和磷酸化，暴露受体DNA结合域，加入5
g双链DNA结合探针ERE孵育10mi
，形成配体ERαDNA探针复合物（ERDNAprobecomplex，ERC）。不加雌激素作空白对照，所有受试样本均做复孔。将ERC加入已经处理好的磁珠固相载体，室温，30rpm轻摇1h，收集磁珠，即得磁珠E2ERαERE复合物，洗涤3次，去除游离的EREDNA。用含1SDS洗脱液重悬磁珠，65℃5mi
，期间于振荡器上剧烈震荡2次，使结合的EREDNA充分洗脱。磁力架上收集上清，加入1μg蛋白酶K，在55℃条件下孵育3h，用酚氯仿异戊醇（25：24：1）抽提，以糖原为载体，用冰无水乙醇沉淀纯化EREDNA，自然凉干，用10μL的TE溶解管底的EREDNA沉淀，20℃保存备用。14荧光定量扩增以纯化后的EREDNA为模板进行10循环的普通PCR预扩增，将结合探针适当放大。取1μL预扩增产物进行荧光定量PCR，20μL反应体系：20μMMGBTaqMa
探针02μL、20μM引物FP和RP各04μL、含有AmpliTaqGoldDNAPolymerase的荧光定量预混master10μL、DNA模板1μL、加去离子水至总体积20μL。扩增条件：95℃预变性10mi
，95℃变性10s、60℃退火延伸1mi
并采集荧光，40个循环。所采用的荧光定量PCR仪为美国Stratage
e公司的Mx3000p，配备的Mx3000p分析软件自行处理相关数据。以扩增中初始循环数（即Ct值）反映体系中原始模板的多少，以无雌激△Ct素的空白对照为本底，采用2算法，从而反映体系中雌激素的诱导效应，即ERE的相对结合量。用spss90软件进行剂量效应曲线拟合，并计算半数有效浓度（EC50）。相对结合量2△Ct，式中△CtCt（样本）Ct（空白对照）。2结果
21ERα体外受体配体结合体系的建立
f在结合体系的确立过程中，对各种条件进行了探索和优化（数据未显示），包括ERα浓度（探索了100
M、50
M、10
M、1
M、01
M等蛋白浓度）、受体配体结合时间（探索了3h、2h、1h、05h）、双链DNA结合探针的种类和浓度（包括COX7RPERE、VitA2ERE两种结合探针，1个ERE及2个ERE两种拷贝，100
g、50
g、10
g、5
g、1
g、01
g六r