迁移实验(cellmigratio
assay)
实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Tra
swell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。实验步骤:1材料准备:可拍照显微镜,Tra
swell小室,孔径8μm,没包被胶的Coster和Cor
i
g公司的也较常用,Tra
swell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Tra
swell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,1胎牛血清DMEM和1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(01(gml)PBS结晶紫)2步骤和流程21基质胶铺板:用BD公司的Matrigel1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Tra
swell小室底部膜的上室面,置37℃30mi
使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。22制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105ml。23接种细胞①取细胞悬液100l加入Tra
swell小室。②24孔板下室一般加入600l含20FBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。③培养细胞:常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。24h较常见,时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。24结果统计直接计数法,“贴壁”细胞计数,这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞。取出Tra
swell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。01结晶紫染色20mi
,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS洗3遍。400倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。
实验材料
f(1)Tra
swellchamber24well80μmporemembra
esCor
i
g(2)细胞培养相关试剂:无血清培养基,10%血清培养基,PBS,002%EDTA(3)固定液:甲醇(4)染色液:Giemsar