第一章蛋白表达纯化
一、诱导表达分析1把测序正确的表达质粒转化到合适的表达宿主菌中并涂布在相应抗性的LB平板上培养过夜2分别挑两个单克隆于3ml含抗生素的LB培养基中培养过夜3按1接种过夜培养的菌液于4ml含抗生素LB培养基中37度培养23小时4加入终浓度为01mM的IPTG诱导表达3个小时左右，取样做蛋白电泳分析目标蛋白的表达情况。二、蛋白纯化21重组蛋白的提取211提取缓冲液
20mMTrisHClpH80或者其他推荐使用的缓冲体系。如需溶解难溶蛋白或者包涵体还可加入8Murea或6Mgua
idi
ehydrochloride。Note处理His6融合蛋白时可以加入550mMimidazole以减少上柱时的非特异性吸附。212方法1发酵液离心收集菌体at70008000gfor10mi
utesor10001500gfor30
mi
utesat4°C。2弃去上清液，加入适当的20mMTrisHClpH80，重悬；3离心收集菌体同上，弃去上清液，将装有菌体的离心管置于冰中。4每ml菌体加入50ul冰冷的提取缓冲液重悬菌体。5冰浴中超声裂解菌体超声2秒，停止6秒，之后取样进行SDSPAGE电泳分
析。
Note超声破菌应尽量使用最短的时间，长时间的进行可能会破坏蛋白功能。还应避免
产生泡沫，因为这样会使蛋白变性和导致宿主蛋白与融合蛋白协同纯化。6离心使细胞碎片沉降at12000gfor10mi
utesat4°C。7小心将上清液移到干净的容器中，并取样进行SDSPAGE电泳分析。
fNote含有8Murea的样品可以直接电泳上样，但含有6Mgua
idi
ehydrochloride的样品必须换成8Murea才可上样。
8样品上样前必须完全溶解并用稀释或换液的方法调整缓冲液。9如样品暂时不使用应存于20°C。
22Ni柱纯化His6融合蛋白1缓冲液：
a、Startbuffer002Msodiumphospate05MNaCl550mMimidazolepH74
b、Elutio
buffer002Msodiumphosphate05MNaCl05MimidazolepH74
Note如recombi
a
tHis6taggedprotei
表达成包涵体还需加入6Mgua
idi
ehydrochlorideor8Murea。
2层析柱准备：用Startbuffer平衡10柱体积3样品纯化：
a用startbuffer平衡510柱体积；b上样；c用startbuffer洗涤510柱体积；d用Elutebuffer洗脱1020柱体积；4层析柱清洗CIP：2MNaCl反向清洗05个柱体积，洗15分钟；1MNaOH以1mlmim反向洗40mi
。
23GST柱纯化GST融合蛋白1缓冲液：
aStartbufferPBSpH74bElutio
buffer50mMTrisHCl，10mMreducedglutathio
epH802样品纯化：a用startbuffer平衡510柱体积；b上样；
fc用startbuffer洗涤510柱体积；d用Elutebuffer洗脱1020柱体积；3层析柱清洗CIP：6Mgua
idi
ehydrochloride清洗2个柱体积。
24离子交换层析IEC
1缓冲液：a、Star