构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于586lkJmol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7deaza2′脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
11引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。做RealTime时用于SYBRGree
I法时的一对引物与一般PCR的引物在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：1避免重复碱基，尤其是G2Tm5860度。3）GC308043端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C5正向引物与探针离得越近越好，但不能重叠。6PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80250bp之间都可；80～150bp最为合适（可以延长至300bp）。7引物的退火温度要高，一般要在60度以上；要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。至于设计软件，PRIMER3PRIMER5PRIMEREXPRESS都应该可以的。做染料法最关键的就是寻找到合适的引物和做污染的预防工作。对于引物，你要有从一大堆引物中挑出一两个能用的引物的思想准备寻找合适的引物非常不容易。关于BLAST的作用应该是通过比对，发现你所设计的这个引物，在已经发现并在GENEBANK中公开的不物种基因序列当中，除了和你的目标基因之外，还有没有和其他物种或其他序列当中存在相同的序列，如和你的目标序列之外的序列相同的序列，则可能扩出其他序列的产物，那么这个引物的特异性就很差，从而不能用。
fPCR操作规程
PCR与定量PCR反应最大的魅力是扩增能力与高灵敏度，但易污染一直是困扰各实验室的大问题，极微量的污染就可能造成假阳性反应，破坏实验结果。如何监测与防止PCR污染，是现在各实验室的重要课题。
一、污染监测一个好的PCR实验室，必须要时刻注意污染的监测，考虑是否受到污染，如有污染，是何原因造成的。通过有效地监测，采取正确的相应措施，防止或消除污染。
对照实验是监测PCR污染的重要手段。1阴性对照：阴性对照是每次PCR实验都必须做r