PCR常见问题分析及对策无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性
问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因1模板含有抑制物，含量低2Buffer对样品不合适3引物设计不当或者发生降解4反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策1纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2更换Buffer或调整浓度3重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4降低退火温度、延长延伸时间
问题2：非特异性扩增
原因：1引物特异性差2模板或引物浓度过高3酶量过多4Mg2浓度偏高5退火温度偏低
现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带
f6循环次数过多对策：1重新设计引物或者使用巢式PCR2适当降低模板或引物浓度3适当减少酶量4降低镁离子浓度5适当提高退火温度或使用二阶段温度法6减少循环次数
问题3：拖尾
现象：产物在凝胶上呈Smear状态。原因：1模板不纯2Buffer不合适3退火温度偏低4酶量过多5dNTP、Mg2浓度偏高6循环次数过多对策：1纯化模板2更换Buffer3适当提高退火温度4适量用酶5适当降低dNTP和镁离子的浓度6减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交污染对策：1操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管
f及加样枪头等均应一次性使用。3各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR引物设计的黄金法则（转自tia
ge
）1引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAma
）比对（Alig
me
t），各基因相同的序列就是该基因的保守区
2引物长度一般在1530碱基之间。引物长度（primerle
gth）常用的是1827bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
3引物GC含量在4060之间，Tm值最好接近72℃。GC含量（compositio
）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melti
gtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值510℃。若按公式Tm4（GC）2（AT）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
4引物3′端要避开密码子的第3位。如扩增编码区域，引物3′r