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电场作用下,溶液就向一定方向移动,此种现象称为电渗。如纸上电泳所用的滤纸纤维素带有负电荷;琼脂糖电泳中,所用的琼脂糖由于大量硫酸根的存在也带有负电荷,它们使水感应产生水合氢离子H3O。在外电场的作用下,水向负极移动。如果被测定样品也带正电荷,则移动更快;如果被测定样品带负电荷,则移动减慢。所以电泳时,颗粒泳动所表现的速度决定于颗粒本身的泳动速度和溶液的电渗作用。因此在选用支持物时,应尽量避免高电渗作用的物质。
3醋酸纤维素薄膜电泳
醋酸纤维素薄膜电泳是利用醋酸纤维素薄膜做固体支持物的电泳技术。醋酸纤维薄膜具有匀一的泡沫状结构(厚约120μm),渗透性强,对分子移动无阻力,用它做区带电泳的支持物,用样量少,分离清晰,无吸附作用,应用范围广和快速简便且染色后的薄膜可用乙醇和冰醋酸溶液浸泡透明,透明后的薄膜便于保存和定量分析。
本实验以醋酸纤维素薄膜作为支持物,于薄膜一端加微量血清,膜两端连接于缓冲液。血清蛋白质的等电点均低于pH70,电泳时常采用pH86的缓冲液,因此,各种蛋白质皆带负电荷,在电场中向正极移动,因泳动速度不同而被分离。醋酸纤维素薄膜电泳可把血清蛋白质分离为清蛋白A、α1、α2、β和γ球蛋白,将蛋白质染色后,可按染色区带位置进行定性观察,也可对各条色带进行定量测定。
f实验步骤
1点样将醋酸纤维薄膜25cm×8cm一条,浸于巴比妥缓冲液,待完全浸透后,取出轻轻夹于滤纸中,吸去多余的溶液,再于薄膜的无光泽面的一端20cm处,用小玻片蘸取少许血清,垂直印于膜上,待血清渗入薄膜后,以无光泽面向下,两端用数层浸湿的滤纸或纱布贴紧,加盖,平衡2~3mi
,然后通电。2通电一般电压用110~140V,电流约04~06mA/cm,时间45~60mi
。3染色关闭电源后立即将膜取出,放入染色液中浸染2~3mi
,然后移入漂洗液中漂洗数次,至蛋白条带清晰,背景无色为止。
4定量取试管6支,编号依次为0(空白)、A、α1、α2、β、γ,将电泳图谱亦按A、α1、α2、β、γ蛋白区带剪开,分别装入相应号码试管中。再在图谱两端无蛋白部位剪一条宽约α1带的空白带放入空白管中。各管中加04molLNaOH4ml,振摇数次,使染料色泽浸出,30mi
后,在620
m波长下进行比色,以空白管校正零点,读取清蛋白及α1、α2、β及γ球蛋白各管的吸光度。
【计算】
吸光度总和T为各种蛋白吸光度的总和:TAα1α2βγ。分别按下面算式计算各组分r
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