免疫学实验课讲义供实验课教师使用实验四ELISA一、课程情况介绍（8：00－8：20，20分钟）本次实验课是第四次也是最后一次免疫学实验课，包括两个内容。第一个实验也是主要的实验是应用ELISA法检测小鼠血清抗绵羊红细胞抗体水平。第二个小实验是胶体金技术早孕检测。ELISA实验需要同学写实验报告。实验报告包括实验原理、实验目的、实验相关试剂、器材、实验流程、实验结果、讨论分析和注意事项几个部分。并且需要把前面几次实验课涉及ELISA的内容也要写进来。ELISA全称为E
zymeLi
kedImmu
osorbe
tAssay中文称为酶联免疫吸附试验。ELISA是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。常用的酶包括辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶，底物为邻苯二胺。常用的几种方法包括间接法、双抗体夹心法和抗原竞争法。ELISA包括抗原包被、封闭、抗原抗体反应、底物显色和结果分析几个步骤。其中抗原包被和封闭已于第一次实验课已完成。同时第一次课我们进行了小鼠的腹腔免疫。一周后小鼠体内应该产生抗绵羊红细胞的抗体。在第二次实验课中通过眼球取血，获得了收集了血清并离心冻存。那么本次实验就是通过ELISA技术来检测小鼠抗绵羊红细胞抗体水平。因为孵育时间很长，为了能按时完成实验，我们先操作，具体原理我们会在试验的孵育过程中讲解。实验器材1包被、封闭好的酶标反应板（老师课前15分钟将第一次课包被的反应板和第二次课20℃冻存的小鼠血清样品取出，室温溶化）。2微量加样器（提醒同学使用的注意事项）和枪头。3温箱、EP管、ELISA盖子、珐琅盘（垫好湿纱布）。4酶标仪，乳头吸管、滤纸（勿扔入水槽）。实验试剂1待测血清及阳性对照和阴性对照血清。2样品稀释液（PBS，PH74）：最常使用的等渗缓冲液。3包被液：绵羊红细胞裂解液。4封闭液（5BSAPBS溶液）：BSA或脱脂奶粉，与免疫反应无关的蛋白质成分。为了封闭板底的未吸附SRBC的空隙，防止样本（抗体蛋白）借空隙与板吸附，导致假阳性结果。5洗涤液（PBST，PH74）：含Twee
的磷酸盐缓冲液，Twee
是去垢剂，PBS是常用的等渗缓冲液，常用做洗液。Twee
可增加洗液的表面张力，加强洗涤效果。6辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠抗体；酶标二抗，一端与辣根过氧化物酶结合，另一端与血清中抗SRBC抗体的C区结合7底物缓冲液A液（01molL枸橼酸溶液）B液（02molLNa2HPO4）：底物是现用现配，A和B液混合后，15mi
内使用。8终止液：成分r