蛋白质提取、纯化、鉴定的方法（二）
一、层析技术1离子交换层析的亲和洗脱这种技术结合了离子交换与亲和层析。如在某一pH时，目的蛋白质带正负电荷，用阳阴离子交换剂吸附，这一过程去除了很大一部分不吸附的杂蛋自。然后用该目的蛋白质的配体来洗脱，该配体特异性地结合目的蛋白质并使之洗脱，但不洗脱其他吸附的蛋白质，达到纯化的目的。注意，该配体需带有一定量的阴阳电荷，有效降低目的蛋白质与阳阴离子交换剂之间的电荷相互作用。2固相金属亲和层析重组蛋白质可在C或N端引入组氨酸标签，一般为6个组氨酸残基Histag。这些组氨酸残基与过渡金属tra
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almetalsNi2或Co2形成配位键。用固相化的Ni2或Co2如商品化的树脂，NiNTA可吸附带有Histag的重组蛋白质，用含有咪唑imidazole的缓冲液可洗脱重组蛋白质。注意，有些含有较多组氨酸的蛋白质也可与吸附剂结台，但较弱，因此可用低浓度的咪唑洗脱；在层析过程中不能引入金属螯合剂如EDTA；避免使用还原剂如DTT或DTE，但可用低浓度的巯基乙醇。该技术也用于提取磷酸化的蛋白质。将螫合剂交联到树脂，螯合三价铁或三价镓，该亲和吸附剂可吸附混合物中的磷酸化的蛋白质。洗去不吸附的非磷酸化蛋白质后，用磷酸缓冲液即可将磷酸化蛋白质从该亲和吸附剂上洗脱。要注意的是酸性蛋白质也可被不同程度地吸附。3凝胶过滤该技术过去也被称为分子筛。构成凝胶的小珠bead中有大小不一的孔，分子量大的分子能进入较大的孔而不能进入小的孔，分子量小的则不仅能进入较大的孔也能进入小的孔，因此在层析过程中，小分子经过的路程较长而大分子经过的路程较短，如此就可分离分子量不同的蛋白质。然而，分子量相近的蛋白质非常多，因此，用这种技术得到的蛋白质是分子量相近的混合蛋白质。然而这种技术在某些研究中很有用，如丙酮酸激酶M2PKM2由四个相同的亚基组成，PKM2在细胞中以三种形式存在单体、二聚体、四聚体，这三种形式的功能不同，若要鉴定细胞中PKM2的各种形式的量，先用凝胶过滤技术分离细胞裂解液中的PKM2的三种形式，之后用Wester
blot对每一种形式的PKM2做相对定量。4反相层析该技术是指用疏水固相的一种层析技术。“反相”是相对“正相”而言，正相是指亲水的固相如硅胶表面带有硅羟基sila
olgroup，硅羟基可与被分离的化台物相互作用，被分离的化合物的亲水性越强，则滞留在正相
f柱上的时间越长。反相层析则在固相表面引入不同长度的烷基C4，C8，C12，C18，使r