固相表面呈疏水性，烷基与被分离的化合物表面的疏水基团相互作用。不同的蛋白质分子表面的疏水基团量和空间分布不同，因此不同蛋白质的疏水性不同，疏水性越强，在反相柱上的滞留时间越长，疏水性越弱，在反相柱上的滞留时间越短。用反相层析技术可将疏水性不同的蛋白质分开。反相层析的分辨率非常高，若不考虑蛋白质的活性，反相层析是非常有效的分离和纯化的手段。反相层析技术也可用于鉴定蛋白质纯度。反相层析技术串联质谱是当今鉴定蛋白质分子的重要手段。要注意的是，该技术对样品的制备要求非常高，样品必须是纯净无颗粒物，样品制各的质量直接影响分离，若样品制备差，会直接损毁柱子；要考虑反相柱的孔径poresize，选择适合分离蛋白质的反相柱。二、电泳分离技术1SDSPAGE常用于鉴定蛋白质的纯度和分子量，也可用于蛋白质的纯化。SDSPAGE凝胶分为两层，上层为浓缩胶，下层为分离胶。浓缩胶的作用是将样品中的蛋白质压成个薄层，分离胶将各种分子量不同的蛋白质分开。SDS带负电，当SDS与蛋白质混合后，SDS与蛋白质分子结合形成复合物，复合物中SDS所带的负电荷大大超过了蛋白质分子所带的电荷，因此在电泳时，蛋白质电泳速率与蛋白质分子量的对数成反比，而蛋白质所带电荷对电泳速率的影响可忽略不计。SDSPAGE的分辨率非常高。该技术要注意4点：①配胶时，所有溶液都要脱气。丙烯酰胺和交联剂亚甲基双丙烯酰胺的交联需要自由基的催化，自由基由过硫酸铵和TEMED四甲基乙二胺产生。空气中的氧气可有效清除由过硫酸铵和TEMED产生的自由基，因此抑制丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺的多聚化polymerizatio
。不脱气也将导致凝胶质量的批次间差异。②SDS的质量非常重要，SDS中的不纯物C10，C14，C16alkylsulfate可导致一个蛋白质形成多个条带。③SDS不要过量，如30～50μl样品中SDS量不要多于200μg，不然蛋白质的条带会变宽，影响分辨率。④过硫酸铵不稳定，需在使用前配制。2等电聚焦蛋白质是两性电解质，当某个蛋白质在某一pH值时，其所带正电荷和负电荷数相等，净电荷为零，这一pH值就是该蛋白质的等电点。各种蛋
f白质的碱性和酸性氨基酸残基的量存在差异，这种差异导致蛋白质的等电点不同。根据这一特性可将等电点不同的蛋白质用等电聚焦方法分离。IEF也可用于分离修饰与否的蛋白质，如蛋白质可被磷酸化加入电荷、乙酰化中和电荷，IEF可将修饰与否的蛋白质分离开反相层析法也可以。IEF对样品的制备要求是，要预防同种或不同r