小鼠单抗腹水纯化
一、初纯辛酸硫酸铵法
【原理】
在酸性条件下（pH45），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等
短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度
较高的IgG。辛酸硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】
1、60mM的醋酸缓冲液（pH40）200ml
取02M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为40402M醋酸缓冲液母液60ml：○102mM乙酸492ml，折合566μl的冰乙酸。
○202M乙酸钠108ml（02M乙酸钠：272g三水合乙酸
钠（MW13608），溶解于100mlddH2O中）2、10PBS01MpH74500ml
取02MPB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9），此时
pH约为735，调pH至74
02MPB母液250ml：02MNa2HPO402MNaH2PO4
3、1MTrisCl（pH90）100ml
2025ml475ml
（折合145gNa2HPO412H2O）（折合1482gNaH2PO42H2O）
称取1211gTrisBase（MW1211），加水至98ml，用HCl调pH至90
【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15mi
，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH40）稀释后，用1MNaOH调pH至45（一般pH刚好在45左右，可不再调）。3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μlml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30mi
，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。4、12000rmi
，4℃，30mi
，收集上清。5、上清液经普通滤纸过滤1次，加入110体积的10PBS（01MpH74）用1MNaOH调至74，冰浴至4℃。6、根据每ml上述混合液加0277g固体硫酸铵（0℃条件下，45饱和硫酸铵为0291gml），冰浴条件下边搅拌边缓慢加入硫酸铵，不可一次全部加入，而以小分量分多次慢慢溶入，并不时搅拌，以免造成局部浓度过高。缓慢加入时为了避免局部的浓度一下子很高，因为硫酸铵不同的浓度是沉淀不同的蛋白为主，这样就可能将不想沉淀的蛋白沉淀下来。冰浴条件是为了保证蛋白的活性，因为硫酸铵加入到辛酸溶液后会产热。7、硫酸铵全加入后，再搅拌1030mi
，使溶液完全平衡，然后就可以进行离心。一般采取4℃搅拌30mi
后，继续静置至少60mi
（一般过夜）。再13000rmi
，4℃离心30mi
，弃上清，在短暂离心，将沉淀溶解于少量PBS中。但如果进行下面的亲和层析，可直接将沉淀溶解于15ml结合缓冲液中。
二、亲和层析【HiTrapProtei
AGHP1ml（AmershamBioscie
ce）特性】柱床体积：1ml
f柱子大r