胶体金标记的实验操作
（时间2008528180538）
（1）蛋白质的处理：胶体金标记蛋白的制备胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值，在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下，二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时，则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。1）待标记蛋白溶液的制备将待标记蛋白预先对0005MolLpH70NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100000g4℃离心1h，去除聚合物。2）待标胶体金溶液的准备以01MolLK2CO3或01MolLHCl调胶体金液的pH值。标记IgG时，调至90；标记McAb时调至82；标记亲和层析抗体时，调至76；标记SPA时，调至59～62；标记Co
A时，调至80；标记亲和素时，调至9～10。由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。（2）蛋白质最适用量的选择：胶体金与标记蛋白用量之比的确定1）根据待标记蛋白的要求，将胶体金调好pH之后，分装10管，每管1ml。2）将标记蛋白（以IgG为例）以0005MolLpH90硼酸盐缓冲液做系列稀释为5gml～50gml，分别取1ml，加入上列金胶溶液中，混匀。对照管只加1ml稀释液。3）5mi
后，在上述各管中加入01ml10％NaCl溶液，混匀后静置2h，观察结果。4）结果观察，对照管（未加蛋白质）和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10％～20％。将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取01ml含蛋白质5～40ug加到1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入01ml10NaCl溶液，混匀后静置2小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10即为最佳标记蛋白量。（3）标记：胶体金与蛋白质（IgG）的结合将胶体金和IgG溶液分别以01MolLK2CO3调pH至90，电磁搅拌IgG溶液，加入胶体金溶
液，继续搅拌10mi
，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白r