化学与生物工程学院生物工程系
生物化学实验报告
课程名称:实验项目:实验室名:实验时间:任课老师:
生物化学氨基酸的分离鉴定纸层析法
生物化学实验室20121115杨艳
专业班级:生物工程1142学生姓名:晔学号:201121030219组别:第五组
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实验内容【实验目的】
通过氨基酸的分离,学习纸层析法的基本原理,掌握氨基酸纸层析的操作方法。
【实验原理】
纸层析法(paperchromatography)通常用于蛋白质的氨基酸成分的定性和定量。1944年A.J.P.马丁第一次用纸层析分析氨基酸,得到很好的分离效果。到现在为止,纸层析法已经成为定性或定量测定多肽,核酸碱基,糖,有机酸,维生素,抗生素等物质的一种最简单易行的分离分析工具。
层析用于分析简单的混合物时可做单向层析。对于复杂的混合物,可做双向层析。其原理是以滤纸为惰性支持物的分配层析,层析溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性,吸附一层水作为固定相,有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时,由于分配系数不同,结果物质在两相间不断分配而得到分离。
其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中,点样在滤纸的一端;再选用适当的溶剂系统,从点样的一端通过毛细现象向另一端展开,展开完毕,取出滤纸晾干或烘干,再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经展开后某一物质在纸层析谱上的位置常用比移值(rateoffolwRf)来表示。Rf原点至层析斑点中心的距离原点至溶剂前沿的距离XY
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与被测物的结构、性质、溶剂
系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用单向纸层析法分离氨基酸。
【实验器材】
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1器材层析缸、毛细管、小烧杯、量筒、培养皿、分液漏斗、层析滤纸新华一号、喷雾器
(或白瓷盘),烘箱(或吹风机)、铅笔、直尺
2试剂
1、扩展剂40mL将20mL水饱和的正丁醇和5mL醋酸以体积比4:1在分液
漏斗中进行混合。然后与15mL蒸馏水混合,充分振荡,静置后分层,放出下层水层。取
漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡溶剂,其余的倒人培养皿中备用。
2、氨基酸溶液
0.5%的赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液各组份
浓度均为0.5%各配置5mL。
3、显色剂50~100mL0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。
【实验步骤】
(1)检查培养皿是否干燥、洁净;若否,将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。(2)平衡r