及阴性对照：阳性对照使用能出现扩增条带的最低量的标准病原体DNA，阴性对照不加模板或加其它来源的DNA，试剂加样操作取量同待测标本。2）污染源的处理①稀酸或84′消毒液处理法：用1molLHCl或适量84′消毒液处理污染源，使残存的DNA脱嘌呤降解。②紫外线照射法：选用波长254300
m的紫外线照射30mi
即可。紫外线对500bp以上DNA片段有效，对短片段效果不大。③反应液污染的处理：在PCR反应液（不含TaqDNA聚合酶和模板）中加入05UDNaseI或核酸内切酶（如10U的MspI），室温下3060mi
。加热灭活DNaseI或核酸内切酶，再加入TaqDNA聚合酶和模板做PCR。
f第二节酶切技术
目的：目的：掌握限制酶消化PCR产物的一般方法。原理：原理：线粒体12SrRNA基因如无A1555G突变，则有BsmAI识别位点，PCR产物被酶切，琼脂糖凝胶电泳可见两个片段，如12SrRNA基因发生A1555G突变，则无BsmAI识别位点，PCR产物不被酶切，琼脂糖凝胶电泳仅见一个片段。限制酶BsmAI识别序列如下：5GTCTCN33CAGAGN5试剂：试剂：（1）10×酶解缓冲液：购于供应酶的厂家。（2）限制性核酸内切酶BsmAI（10uul）（3）100bpDNAladder（4）10琼脂糖凝胶（5）TAE缓冲液操作步骤：操作步骤：1．在Eppe
dorf管中依次加入35l1l5l05l双蒸水10×酶切缓冲液DNABsmAI（10ul）
2．将装有上述反应液的Eppe
dorf管于37℃水浴保温1小时。该反应液作为样品Ⅰ。3．以样品Ⅰ、未酶切PCR产物和DNAmark样品同时进行10琼脂糖凝胶电泳。4．电泳结束后紫外灯下观察结果。注意事项：注意事项：1．PCR引物设计时，尽量选择基因两侧的保守区，在PCR扩增时，注意
fMg2对Taq酶活性的影响。2．限制性内切酶在适宜的反应条件下会完全按照其固有的性质识别并切割特异性碱基序列，但在非理想的条件下，如反应体系pH值和反应温度等发生变化，或模板DNA含有乙醇等，均会使限制性内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，从而产生非特异性酶解DNA片段，这一现象称酶的星号活性现象。星号活性出现的频率根据酶、底物、反应条件的不同而异，在非最佳条件下进行酶切反应容易出现星号活性，尽量用较少的酶进行完全消化反应（一般酶都贮存于50的甘油中），这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度干扰，样本DNA在酶切反应之前要纯化去除杂质避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染，并优化酶切反应体系pH值、离子等。3．PCRRFLP若酶切不完全，会影响基因型的判断，造成误检或漏检，因此宜采用酶r