解4h或过夜，充分酶切。4．RFLP酶解片段在电泳分离的过程中，要根据片段的大小选择不同的琼脂糖浓度，如果产生的片段大部分小于500bp以下，可选用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。常见问题及分析：常见问题及分析：底物DNA没有被切开或者切割不完全。出现这种现象可以有很多原因，首先考虑是DNA本身的原因如DNA不纯、缺少识别序列、DNA甲基化等，另外限制性内切酶部分失活，酶存在星号活性，反应条件不合适等，都会使DNA酶切失败。酶切后除了目的DNA条带外，还有其它条带。酶存在“星号”活性或其它内切酶污染使底物产生非特异切割。在进行PCRRFLP时，设置阳性对照十分重要，以便在实验中查明失败原因。因此，在设计一个PCRRFLP实验的时候，应该先寻找突变前后存在的自然酶切位点，当没有这样的位点存在时，可以通过设计引物引入特定的限制性内切酶酶切位点。在应用RFLP检测点突变时可能会引起假阳性，特别是在发生缺失突变时，酶切位点消失，目的片段不能够被切开，在进行临床诊断的时候要特别注意。
f第三节
目的：目的：掌握琼脂糖凝胶电泳基本操作原理：原理：
琼脂糖凝胶电泳技术
琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是D半乳糖和36脱水L半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比；分子构型也对迁移率有影响，如共价闭环DNA＞直线DNA＞开环双链DNA。当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状DNA（球形）不能进入胶中，相对迁移率为0，而同等大小的直线DNA（刚性棒状）可以按长轴方向前移，相对迁移率大于0。在电泳过程中，凝胶中的溴化乙锭EB嵌入DNA分子中，在紫外线照射下，EBDNA复合物发出橙红色荧光。试剂：试剂：（1）琼脂糖（2）TBE（008molLTrisHCl，pH85，008molL硼酸，00024molLEDTA）（3）溴化乙锭（EB）操作步骤：操作步骤：（1）凝胶制备用TBE缓冲液配制1％琼脂糖凝胶溶液，沸水浴或微波炉加热使之融化，冷至55℃时加入溴化乙锭（EB）至终浓度为05gml，然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子中，厚度依样品浓度而定。注胶时，梳齿下端距玻璃板0510mm，待脱凝固后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下1mm处。（2）样品制备与加样：将DNA溶液按51溶解于6×Lodi
gBuffer缓冲液中，上样r