io
buffer5l1mmolLDIG11dUTPBioti
16dUTP05lNickTra
slatio
E
zyme10lDNA1gXlH2O18Xli
total50l以上为标记1gDNA的缺口平移体系若标记更多量的DNA则试剂量和反应体系相应等倍扩大各成分混匀后短时离心对于≤10kb的质粒于15℃反应35小时对于BACPAC于15℃反应9小时13凝胶电泳判断探针大小将EP管置于冰上取其中5l于70℃加热5分钟后行2琼脂糖凝胶电泳以观察所标记探针的大小单一序列探针合适大小为200～600bp如片段大小偏大则于15℃延长反应10～30分钟再重复进行凝胶电泳直至得到合适大小的探针14终止反应向反应体系中加入1l05MEDTA和或70℃加热5分钟以灭活酶探针于20℃保存备用第二天1探针的沉淀和变性11探针混合物的组成1对BACPAC探针DNA探针5ulHuma
Cot1DNA3ulSalmo
SpermDNA05ulH2O15uli
total10ul2对着丝粒探针DNA探针5ulSalmo
SpermDNA05ulH2O45uli
total10ul12DNA的沉淀将探针混合物与1ulV103M醋酸钠PH52和275ul25V无水乙醇20℃冻存混合80℃沉淀30mi
或20℃沉淀过夜以14000g在4℃离心30mi
以沉淀DNA13清洗沉淀小心弃去上清用70乙醇洗涤一次再次以14000g在4℃离心15mi
小心弃去上清在45～50℃的中温水浴中风干DNA沉淀10～15mi
注当大部分乙醇蒸发时白色的DNA沉淀变为半透明状一定要彻底清除乙醇否则会在加入Master
fMix后产生微小的沉淀导致高背景14溶解探针加入5l预热至37℃的去离子甲酰胺PH70短时离心后在37℃振摇30mi
以充分溶解DNA再加入预热至37℃的MasterMix5l短时离心后在37℃振摇15～30mi
注振摇时间尽可能延长DNA沉淀亦可以TE缓冲液11l溶解后加入Vysis探针缓冲液44l稀释混匀后瞬时离心37℃振摇15～30mi
15探针的变性和预杂交短时离心后于80℃水浴中变性探针10mi
冰浴5分钟短时离心37℃水浴中预杂交30～60mi
于独特序列探针如cDNA和重复序列探针如α卫星DNA探针无需预杂交2标本染色体靶DNA的处理和变性21滴片和老化取出储存于20℃的细胞悬液标本以1100rpm离心10mi
沉淀细胞换用适量体积的新鲜甲醇冰乙醇vv31固定液重悬细胞并调整细胞密度滴片划出杂交区域晾干在预热到37℃的2×SSC中老化30mi
也可实验前夜室温过夜老化再以2×SSC浸泡2分钟依次于7090和100的梯度乙醇中依次脱水每缸2mi
晾干以下略作