5mi
次×3次梯度乙醇脱水后凉干23靶DNA的变性将玻片放入预温至72℃每增加一张玻片温度要提高1℃的70去离子甲酰胺2×SSC中变性2分钟后立即置入预冷至20℃保存的梯度乙醇脱水晾干24蛋白酶消化将50l100mgml的胃蛋白酶终浓度为001加入预温至37℃的50ml蒸馏水PH20以适量稀盐酸酸化中混匀将变性后的玻片放入其中处理10分钟室温下1×PBS中振荡洗涤5mi
次×2次室温下梯度乙醇脱水后凉干注靶DNA的变性和消化应与探针变性同步进行完成后尽快进行杂交3杂交将变性后的DNA探针加于玻片杂交区域盖上22mm×22mm盖玻片封片后置于湿盒中37℃杂交过夜第三天1杂交后洗涤和半抗原信号放大11杂交后洗片小心揭去封片胶和盖玻片将玻片置于预热至46℃的50甲酰胺2×SSC中5mi
×3缸将玻片移入室温下4×SSC01Twee
20中振荡洗涤5mi
×2缸每张玻片滴加30l阻断液1盖上22mm×22mm盖玻片于37℃湿盒中孵育30mi
再次将玻片移入室温下4×SSC01Twee
20中振荡洗涤5mi
×2缸注此后步骤应注意避光操作12滴加一抗将4lA
tiDIGmo
oclo
ala
tibody和05lTexasredAvidi
稀释于100l抗体稀释液1中混匀每张玻片滴加25l于杂交区域盖上22mm×22mm盖玻片于37℃湿盒中孵育1小时室温下4×SSC01Twee
20中振荡洗涤5mi
×2缸13滴加二抗
f将4lA
timouseIgDIG和1lBioti
ylatedgoata
tiAvidi
稀释于100l抗体稀释液1中混匀每张玻片滴加25l于杂交区域盖上22mm×22mm盖玻片于37℃湿盒中孵育40mi
室温下4×SSC01Twee
20中振荡洗涤5mi
×2缸14滴加三抗将4lA
tiDIGFluorescei
和05lTexasredAvidi
稀释于100l抗体稀释液1中混匀每张玻片滴加25l于杂交区域盖上22mm×22mm盖玻片于37℃湿盒中孵育30mi
室温下4×SSC01Twee
20中振荡洗涤5mi
×2缸注以上步骤按双色FISH描述若为单色FISH则选择相应抗体即可2核复染和抗荧光淬灭剂封片将125l5mgml的DAPI加入50ml2×SSC中终浓度为125
gml避光保存于4℃混匀将玻片置于其中避光复染2mi
2×SSC中洗涤5mi
梯度乙醇脱水晾干每张玻片滴加10l抗荧光淬灭剂封片盖上22mm×22mm盖玻片20℃避光保存3荧光显微镜检测FISH杂交信号以荧光显微镜观察在DAPIFITCTexasRed滤光镜激发下观察中期间期细胞的荧光杂交信号计数细胞和采集图像每例分析100～200个间期细胞核细胞重叠破损未去除细胞质和杂交信号微弱的细胞核不计入其中对于双色双融合FISH细胞内杂交信号相互靠近110核直径的距离者计为一个信号4储存数据
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