PCR技术的种类及其应用
1PCR技术的基本原理PCR技术是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下依赖于DNA聚合酶Taq酶的酶促合成反应。其具体反应分三步：变性、退火、聚合。以上三步为一个循环，每一循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板，数小时后，介于两个引物之间的目的DNA得到了大量的复制，经25～30次循环DNA数量可达2×106～7拷贝数。2PCR技术的种类21反向PCRI
versePCRIPCR技术原理：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组INA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。该方法的不足是：①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。22锚定PCRA
choredPCRAPCR技术用酶法在一通用引物反转录cDNA3’末端加上一段已知序列然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增称为APCR。应用：它可用于扩增未知或全知序列如未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建。
23不对称PCRasymmetricPCR技术
两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度常用50～100÷1比例。在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA但
f当低浓度引物被消耗尽后高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。应用：可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。24反转录PCRreversetra
scriptio
RTPCR技术当扩增模板为RNA时需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。RTPCR应用非常广泛无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。25修饰引物PCR技术为达到某些特殊应用目的如定向克隆、定点突变、体外转录及序列分析等可在引物的5’端加上酶切位点、突变序列、转录启动子及序列分析结合位点等。26巢式PCRNESTPCR技术先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量然后再用一对内引物扩增以得到r