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PCR技术的发展及应用
平骏14112822276摘要:聚合酶链式反应(PolymeraseChai
Reactio
PCR)是1985年由美国PECetus公司的科学家
KaryBa
ksMullis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。经历了近30年的技术发展,现如今PCR技术在生命科学研究以及相关的很多领域都得到广泛的应用。本文主要对PCR的基本原理、反应组份作简要的介绍;同时也对在PCR基础上发展起来的相关技术作简要综述。关键词:PCR技术;PCR原理;PCR新技术
对核酸的研究己有100多年的历史,20世纪70年代初人们就致力于研究基因的体外分离技术,Kora
a于1971年最早提出核酸体外扩增的设想,该设想在1985年被Mullis等人实现,他们发明了具有划时代意义的聚合酶链反应6。这项新技术是根据生物体内DNA序列能进行快速复制的特点,实现在体外对特定DNA序列进行快速扩增,可在短时间内从试管中获得数百万个特异DNA序列拷贝。PCR技术操作简便、结果可靠,被世界各国广泛应用于医学、农业、考古学等各个领域的基因研究和分析,对分子生物学的发展产生了深远的影响18。发明人KaryBa
ksMulis也因此荣获了1994年的诺贝尔化学奖。
1、PCR技术的原理12
PCR技术是模拟细胞内DNA的天然复制过程,DNA聚合酶以单链DNA为模板,借助一小段双链DNA来启动合成,通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合,形成部分双链。在适宜的温度和环境下,DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3,OH末端,并以此为起始点,沿模板5,→3,方向延伸,合成一条新的DNA互补链。简言之,其基本原理包括3个基本反应过程:变性→退火→延伸。PCR反应的基本成分包括:模板DNA待扩增DNA、引物、4种脱氧核苷酸dNTPs、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。每一循环中所合成的新链,又都可作为下一循环中的模板。PCR合成的特定的DNA序列产量随着循环次数呈指数增加,每完成一次循环需24mi
,23h就能将目的基因扩增,从而达到迅速大量扩增的目的。
2、PCR技术的反应组份
21模板DNAPCR反应的模板可以是单链DNA也可以是双链DNA,可以是基因组DNA或cDNA,
fmRNA也能作为PCR的模板,只需用逆转录酶把mRNA逆转录为cDNA即可。模板量的多少及其纯度的高低,是PCR成败与否的关键因素之一6。由于PCR反应的特异性由寡聚核苷酸引物决定模板DNA不需要高度纯化,但应避免任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、能结合DNA的蛋白质及多糖类物质的污染18。PCR所需模板DNA的量极微通常在纳克级范围内,通常适宜r
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