特异的PCR带此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些且用量较少同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度这样在第一次PCR时由于较高退火温度下内引物不能与模板结合故只有外引物扩增产物经过若干次循环待外引物基本消耗尽无需取出第一次PCR产物只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCRdropi
dropoutPCR。上述三种方法主要用于极少量DNA模板的扩增。27等位基因特异性PCRAllelespecificPCRASPCR技术ASPCR依赖于引物3’端的一个碱基错配不仅减少多聚酶的延伸效率而且降低引物模板复合物的热稳定性。这样有点突变的模板进行PCR扩增后检测不到扩增产物可用于检测基因点突变。28单链构型多态性PCRsi
glestra
dco
formatio
alpolymorphismPCRSSCPPCR技术SSCPPCR是根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中单链DNA迁移率除与DNA长度有关外更主要取决于DNA单链所形成的空间构象相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异所形成的构象就会不同PCR产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳时每条单链处于一定的位置靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单
f个碱基置换时就会出现泳动变位从而提示该片段有基因变异存在。29低严格单链特异性引物PCRLowstri
ge
cysi
glespecificprimerPCRLSSPPCR技术LSSPPCR是建立在PCR基础上的又一种新型基因突变检测技术。要求是“二高一低”高浓度的单链引物5’端3’端引物均可约48Lmol高浓度的Taq酶16Lmol100ml低退火温度30℃所用的模板必须是纯化的DNA片段。在这种低严格条件下引物与模板间发生不同程度的错配形成多种大小不同的扩增产物经电泳分离后形成不同的带型。对同一目的基因而言所形成的带型是固定的因而称之为“基因标签”。这是一种检测基因突变或进行遗传鉴定的快速敏感方法。210复合PCRmultiplexPCR技术在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段如果基因的某一区段有缺失则相应的电泳谱上这一区带就会消失。复合PCR主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。211重组PCR技术重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中两对引物分别由其中之一在其5’端和3’端引物上带上一段互补的序列混合两种PCR扩增产物经变性和复性两组PCR产物互补序列发r