制）替代方法2：将脱蜡及水合好的切片浸入胃蛋白酶或胰蛋白酶中810mi
（胃蛋白酶：02505溶于HClPH2，胰蛋白酶02505溶于001NHCl）替代方法3将脱蜡及水合好的切片浸入含200ml01M的柠檬酸缓冲液PH6的塑料盒中，置于微波炉中350W（低档）处理5mi
。5PBS漂洗2次；6制备TUNEL反应混合液：
处理组用50μl1号液450μl2号液混匀；而阴性对照组仅加50μl2号液，
阳性对照组先加入100μlDNase1，反应在1525℃×10mi
，后面步骤同处理组。
7玻片干后，加50μlTUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl2号液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。
8PBS漂洗3次；9可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450500
m，检测波长为515565
m）；
f10玻片干后加50μl3号液（co
verterPOD）于标本上，加盖玻
片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30mi
。11PBS漂洗3次；12在组织处加50100μlDAB底物，反应1525℃×10mi
；13PBS漂洗3次；14拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。15加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜观察凋亡细胞（共计200500个细胞）并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断（未染色细胞变小，胞膜完整但出现发泡现象，晚期出现凋亡小体，贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落；而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状凋亡小体）对于培养细胞的预处理：①在载玻片上铺一层薄薄的多聚赖氨酸，干燥后在去离子水中漂洗，干燥后4℃保存；②适当方法诱导细胞凋亡，同时设未经诱导的对照组，各组离心收集约1×106个细胞，PBS洗一次，重悬，加到铺好的多聚赖氨酸载玻片上，自然干燥，使细胞很好的吸附到载玻片上；③将吸附细胞的载玻片在4多聚甲醛中固定25mi
；④PBS浸洗二次，每次5mi
；⑤将吸附细胞的载玻片在02的Trito
X100中处理5mi
；⑥PBS浸洗二次，每次5mi
；
f后续操作如同石蜡包埋切片的615
四、注意事项1进行PBS清洗时，每次清洗5mi
。2PBS清洗后，为了各种反应的有效进行，请尽量除去PBS溶液后再进行下一步反应。3在载玻片上的样本上加上实验用反应液后，请盖上盖玻片或保鲜膜，或在湿盒中进行，这样可以使反应液均匀分布于样本整体，又可以防止反应液干燥造成实验失败。4TUNEL反应液临用前配制，短时间在冰上保存。不宜长期保存，长期保存会导酶活性的失活。5如果20×DAB溶液颜色变深成为紫色，则不可使用，需重新配制r