。随着近年来分子生物学发展,采用分子生物学方法对双歧杆菌进行属、种、株水平鉴定已有较大进展。221特异性核酸前体或探针直接检测
通过对细菌rDNA序列进行分析,尤其是对16SrDNA序列进行分析,可以从基因序列中得到不同种系发生水平的多个区域的特定基因信息,如科、属、种及亚种水平的基因信息。因此,可以通过检测某种或某些种微生物的特定序列来证明其存在。但这需要精确设计科特异性探针、属特异性探针和种特异性探针作为前提。寡核苷酸探针法可以直接检测特异核苷酸序列。其一般操作是提取样品DNA或RNA,固定在正电荷膜(尼龙膜,硝化纤维膜)上,然后用放射性标记、化学荧光标记或地高辛标记的探针或DNA片断与之杂交,检测信号即可得出阳性结果。近年来报道的各种双歧杆菌属种特异性前体或探针已有很多。此类技术包括各种点杂交技术(Norther
Sorther
杂交及荧光原位杂交等)及最近几年发展起来的DNA微阵列技术DNAmicroarrays。222DNA微阵列技术
DNA微阵列技术的原理是将大量DNA探针固定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号的强弱来判断样品中分子的数量。可在一块支持物上对成百上千的目标DNA进行同时检测。RFWa
g7用此方法检测了人体肠道中常
f见的20种菌(其中包括3种常见的双歧杆菌)。此技术也可用于益生菌制品中双歧杆菌及其它益生菌的同时检出。223FISH荧光原位杂交在荧光原位杂交(FISH)中,目标rRNA序列的检测由荧光标记的寡核苷酸探针杂交来实现。此技术需要特殊的步骤来改变细胞的通透性以使探针进入细菌的细胞中。当细菌中的rRNA分子捕捉到探针后,使用荧光显微技术或血细胞计数的方法检测或计数细菌细胞。ArthurCOuweha
d8报道用FISH方法检测摄食益生菌产品后人粪便样品中的乳酸双歧杆菌Bb12。224分子标记技术
分子标记molecularmarker是指可遗传的并可检测的DNA序列。理想的分子标记必须达到以下几个要求:1高的多态性;2共显性遗传,可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型;3能明确辨别等位基因;4遍布整个基因组;5除特殊位点的标记外,要求分子标记均匀分布于整个基因组;6选择中性(即无基因多效性);7检测手段简单、快速;8成本尽量低廉;9在实验室内和实验室间重复性好。此类的实验技术包括:RFLP(限制性片段长度多态性);RAPD(随机扩增多态性DNA);AFLP(扩增片段长度多态性)和SNP(单核苷酸多态性)及近年来发展起来的较新的ARDRA(扩增DNA限制性分析)等。以下简要介绍其中两种r