【实验原理】纸层析法(paperchromatography)通常用于蛋白质的氨基酸成分的定性和定量。1944
年A.J.P.马丁第一次用纸层析分析氨基酸,得到很好的分离效果。到现在为止,纸层析法已经成为定性或定量测定多肽,核酸碱基,糖,有机酸,维生素,抗生素等物质的一种最简单易行的分离分析工具。
层析用于分析简单的混合物时可做单向层析。对于复杂的混合物,可做双向层析。其原理是以滤纸为惰性支持物的分配层析,层析溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性,吸附一层水作为固定相,有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时,由于分配系数不同,结果物质在两相间不断分配而得到分离。
其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中,点样在滤纸的一端;再选用适当的溶剂系统,从点样的一端通过毛细现象向另一端展开,展开完毕,取出滤纸晾干或烘干,再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经展开后某一物质在纸层析谱上的位置常用比移值(rateoffolwRf)来表示。Rf原点至层析斑点中心的距离原点至溶剂前沿的距离XY
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与被测物的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用单向纸层析法分离氨基酸。【实验器材】
1器材层析缸、毛细管、小烧杯、量筒、培养皿、分液漏斗、层析滤纸新华一号、喷雾器(或白瓷盘),烘箱(或吹风机)、铅笔、直尺
2试剂1、扩展剂40mL将20mL水饱和的正丁醇和5mL醋酸以体积比4:1在分液漏斗中进行混合。然后与15mL蒸馏水混合,充分振荡,静置后分层,放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡溶剂,其余的倒人培养皿中备用。2、氨基酸溶液0.5%的赖氨酸、脯氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液各组份浓度均为0.5%各配置5mL。3、显色剂50~100mL0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。【实验步骤】
(1)检查培养皿是否干燥、洁净;若否,将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。(2)平衡:剪一大块塑料薄膜铺在桌面上,将层析缸或大烧杯到置于塑料薄膜上,再把盛有约5mL展层溶液的小烧杯置于倒置的层析缸或大烧杯中,用塑料薄膜密封起来,平衡20mi
。(3)规划:带上手套,取宽约10cm、高约15cm的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘2~3cm处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A,在直线上做4个记号,记号之间间隔2cm,这就是原点的位置。另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B,在B线上以A、B两线的交点为原点标r