聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段一、实验目的1．学习PCR基因扩增的基本原理和操作方法。2．理解PCR基因扩增在分子生物实验技术中的重要性。3．了解引物设计的一般要求。
二、实验原理多聚酶链式反应PolymeraseChai
Reactio
PCR：原理类似于DNA的变性和复制过程，即在高温（9395℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2
的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。
PCR反应系统的组成：引物、寡核苷酸、TaqDNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。
三、试剂与器材1、试剂10×EXTaqBufferMg2plus；dNTPMixture各25mMTaKaRaEXTaq聚合酶5Uμl；模板DNA已预先稀释；上、下游引物混合物（已预先稀释）2、器材微量移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，PCR扩增仪PTC－100，台式高速冷冻离心机。
四、操作方法1．编辑设定PCR扩增程序。2．PCR管中加入灭菌水、缓冲液、四种dNTP、引物、模板、聚合酶。3．运行程序进行扩增。4．电泳检测扩增结果。
五、关键步骤与注意事项1．试剂湿热灭菌，小管分装，防止污染。2．所用的PCR扩增管、微量移液器的吸头都要灭菌。3．试剂混合时要在超净工作台中，戴上一次性手套，防止污染；要离心混匀。4．每次反应都要设置阴性和阳性对照。5．根据引物的融解温度设定退火温度，防止出现非特异性扩增产物。
六、思考题1、PCR进行的的基本条件是什么？2、PCR每一循环有哪几个步骤组成？3、影响PCR扩增的因素有哪些？4、优化那些条件可以最大限度的减少非特异性扩增？
fPCR扩增产物检测分析琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳
PCR扩增反应完成之后，必须通过严格的鉴定，才能确定是否真正得到了准确可靠的预期特定扩增产物。凝胶电泳是检测PCR产物常用和最简便的方法，能判断产物的大小，有助于产物的鉴定。凝胶电泳常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者主要用于DNA片段大于100bp者，后者主r