T、B淋巴细胞增殖能力测定、NK细胞活性测定及T淋巴细胞亚群测定的方法一、T、B淋巴细胞增殖能力测定
无菌条件下取大鼠的脾脏，加适量Ha
k’s液研磨，以200目不锈钢网滤过，1500rm离心5分钟，弃上清，加Ha
k’s液重复洗涤2次。收集脾细胞，加适量RPMI1640培养液混悬，以04台盼兰拒染法计数，活细胞数不小于95，加RPMI1640完全培养液稀释，并调整细胞浓度至1×107个mL。于96孔微量板中，每孔加100L脾细胞悬液（1×107cellmL）和等体积的Co
A溶液（终浓度为5μgmL）、LPS溶液（终浓度为10μgmL）或RPMI1640培养液，重复3孔。另设空白对照组。37℃、5CO2培养44h后，各孔加入50μLMTT溶液（2mgmL），继续培养4h。1000rmi
离心5分钟，弃去各孔上清，分别加150μL酸性DMSO溶液，振荡，于室温暗处放置15mi
，以酶标仪于波长578
m处测定OD值，并按下式计算刺激指数（SI）：SI（刺激指数）加有丝分裂原培养物的OD值不加有丝分裂原培养物的OD值。
二、NK细胞活性测定
实验前24h将靶细胞YAC1传代培养，应用前以Ha
k’s液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×105个mL。无菌取脾，制备脾细胞悬液，用Ha
k’s液洗2次，每次离心10mi
（1000rmi
）。弃上清将细胞浆弹起，加入05mL灭菌水裂解红细胞，20s后再加入05mL2倍Ha
ks液及8mLHa
ks液，离心10mi
（1000rmi
），用1mL含10小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1冰醋酸稀释后计数，调整细胞浓度为1×107个mL。将靶细胞加入96孔培养板，每孔100μL，试验孔加入100μL脾细胞（效靶比50：1），自然释放孔加入100μL培养液，最大释放孔加入100μL2NP40，37℃培养4h，离心，取上清100μL置96孔酶标板中，加入LDH基质液100μL，反应8mi
，以30μL1molL的HCl终止反应，在酶标仪492
m处测定OD值。NK细胞活性（）（反应孔OD自然释放孔OD）（最大释放孔OD自然释放孔OD）×100
三、T淋巴细胞亚群测定
取血加抗体，大鼠眼眶取血1mL，用EDTAk3血常规管抗凝全血，试管标号；取50μL抗凝全血，分别加入试管①、试管②，直接加至底部，且不可触壁；试管①统一加5μL抗体CD3和5μL抗体CD4，试管②统一加5μL抗体CD3和5μL抗体CD8，用振荡器混匀后暗室放置2030mi
，使抗体与血样充分结合；避光常温30mi
后，加裂解液：试管在振荡中加入500μL裂解液，在30℃水浴中放置15mi
，使细胞充分裂解，达到透亮；裂解后，
f1500rpm离心5mi
，倒去上液，用PBS液洗两遍，加1mLPBS液，1500rpm离心5mi
，后倒去上液；再加1mLPBSr