双分子荧光互补技术在蛋白质相互作用研究中的应用
双分子荧光互补技术（BiFC）是基于两个不发光的荧光蛋白互补片段在借助其融合蛋白的驱动下重新形成活性荧光蛋白，直接作为报告基因的可视化关键性技术，在探究各种模式生物体内蛋白质与蛋白质间相互作用（PPI）技术中日益受到重视。本文对BiFC技术原理、发展过程、应用现状、技术改进、及未来展望进行概述。
细胞内蛋白质通常需要与其他蛋白质或配体结合，形成瞬时或稳定的复合体来实现其特定的功能，这种蛋白质与蛋白质之间的相互作用（protei
protei
i
teractio
，PPI）在人类、酵母、植物、线虫等各种生物体的生命活动中起着十分重要的作用14。目前，PPI研究技术发展迅速，常用的有免疫共沉淀、GSTpulldow
、表面等离子共振（SPR）、蛋白质芯片等体外实验技术，以及酵母双杂交、蛋白质片段互补（PCA）、荧光共振能量转移（FRET）技术等。近十余年兴起的双分子荧光互补（bimolecularfluoresce
cecompleme
tatio
，BiFC）技术由于无需试剂检测，能够通过荧光显微镜在接近活细胞生理状态的条件下快速、直观地检测目标蛋白是否具有相互作用，在PPI研究中的应用正日益广泛。
1BiFC技术的原理
Rega
（2000）和Kerppola（2002）两个研究小组最早发现和验证了活细胞内BiFC现象。他们首先将1个GFP的突变子增强型黄色荧光蛋白（EYFP）从不同位点切开，然后将一组相互作用、同向平行的亮氨酸拉链（bFos和bJu
）分别融合到从Ala154Asp155之间切开的增强型黄色荧光蛋白（EYFP）氨基（N）片段和羧基（C）片段，导入大肠杆菌中共表达。结果发现，所构建的一对融合多肽能够在细菌细胞中产生YFP的荧光，他们将这个现象称之为BiFC56。
除EYFP外，目前BiFC技术涉及的荧光蛋白已扩展到绿色荧光蛋白（GFP）、青色荧光蛋白（CFP）、红色荧光蛋白（RFP）及其突变体等多种荧光蛋白，其原理都是将荧光蛋白在特定的位点切开，形成不发荧光的N和C端2个多肽，称为N片段（Nfragme
t）和C片段（Cfragme
t）。这2个片段在细胞内共表达或体外混合时，不能自发组装成完整的荧光蛋白。但是，当这2个荧光片段分别融合到一组有相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这两组融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的2个互补片段在空间上互相靠近，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，受到激发后发射出特定波长荧光（图1）。
图1BiFC原理示意图
注：NGFP，GFPN端；CGFP，GFPC端；A与B，能发生相互作用的一对蛋白
2BiFC荧光蛋白的发展
f早期r