细胞冻存和复苏技术
一、实验目的
学习与了解细胞超低温冻存于复苏的基本原理，初步掌握培养细胞常规超低温冻存于复苏以及玻璃化超低温冻存于复苏的方法。
二、实验原理
为了保持细胞株（系）遗传的稳定性以及非连续使用细胞的长期保存，建立了细胞超低温冻存于复苏技术。目前细胞超低温冻存技术主要有两种方法，即常规超低温冻存和玻璃化超低温冻存。
活细胞在超低温下克服了分子间的热运动，因而可长期保存而不影响活力。在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，当细胞冷到零度以下，细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶。否则形成大结晶。大结晶会造成细胞膜、细胞器损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。
三、试剂和器材
器材：液氮罐、冻存管（塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶）、离心管、吸管、离心机等。试剂：025％胰酶、培养基、含保护剂的培养基（即冻存液）。
四、操作步骤
（一）冻存1、消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。2、加5mLPBS，1000rpm离心10分钟，弃上清液。重复一次。3、沉淀加含保护液的培养液，计数，调整至5×1000000ml左右。4、将悬液分至冻存管中，每管1ml。5、将冻存管口封严。如用安瓿瓶则火焰封口，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。7、将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液
氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。注意：操作时应小心，以免液氮冻伤。液氮定期检查，随时补充，绝对不能挥发干净，一般30立升的液氮能用1～15月。（二）复苏1、从液氮中取出冻存管、迅速置于37℃水浴中并不断轻轻搅动。使冻存管中的冻存物在1分钟之内融化。2、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。3、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。4、沉淀加10ml培r