荧光定量PCR常见问题及解答更新：20101210104337
一、无Ct值（信号）出现：1反应循环数不够：一般都要在35个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号；2检测荧光信号的步骤有误：一般采用72℃延伸时采集荧光，Taqma
方法则一般在退火结束或延伸结束采集信号；3引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；4探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上而产物已延伸；5模板量少：对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起；6模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生。二、如何确认模板中是否含有PCR反应阻害物质：有时RNA或cDNA模板中存在对反转录和荧光PCR反应的阻害物质。为了确认这样的阻害物质的有无，我们可以使用高浓度的模板按3－4个梯度稀释，并使用其进行荧光定量PCR反应。如果无阻害物质存在，得到的Ct值就会依模板浓度的变化而变化；而如果模板中有阻害物质的存在，实验过程中我们就会发现高浓度的模板有反应性能下降的现象。三、Ct值出现过晚：1反应条件不佳：未最佳反应条件，可重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等；2PCR各种反应成分的降解或加样量不够；3扩增产物片段过长：一般采用100－200bp的扩增长度。四、标准曲线的线性关系不佳：1加样存在误差，标准品稀释不呈梯度；2标准品降解：标准品尽量避免反复冻融；3引物或探针不佳：重新设计；4模板中存在抑制物，或模板浓度过高。五、阴性对照液出现明显的扩增：1荧光PCRmix或水被污染；2引物二聚体的出现：在35循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合溶解曲线进行分析；3反应过程中探针降解：用PAGE电泳对探针进行检测。六、溶解曲线不止一个主峰：1引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现；2引物浓度不佳：适当调整引物浓度；
f3退火温度低：提高退火温度；4镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度；5模板中有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的污染，或通过引物设计避免非特异扩增。七、如何避免荧光定量PCR中基因组DNA扩增：1引物设计时避免基因组DNA扩增；2在RNA提取过程中使用DNaseⅠ处理去除RNA中混有的基因组DNA。八、扩增效率低：1反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解；2反应条件不佳：适当降低退火温度或改为三步扩增法；3反应体系中有抑制物：一般为模板中r