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种r
支持物r
有多种如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等r
但需经特殊处理r
作原位合成的支持物在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基(视所要固定的分子为核酸或寡肽而定)并与保护基建立共价连接;作点样用的支持物为使其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子r
通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等r
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原位合成法主要为光引导聚合技术(Lightdirectedsy
thesis)r
它不仅可用于寡聚核苷酸的合成r
也可用于合成寡肽分子r
光引导聚合技术是照相平板印刷技术(photolithography)与传统的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物r
半导体技术中曾使用照相平板技术法在半导体硅片上制作微型电子线路r
固相合成技术是当前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法r
技术成熟且已实现自动化r
二者的结合为合成高密度核酸探针及短肽阵列提供了一条快捷的途径r
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以合成寡核苷酸探针为例r
该技术主要步骤为:首先使支持物羟基化r
并用光敏保护基团将其保护起来r
每次选取择适当的蔽光膜(mask)使需要聚合的部位透光r
其它部们不透光r
这样r
光通过蔽光膜照射到支持物上r
受光部位的羟基解保护r
因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化r
另一端受光敏保护基的保护r
所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团r
因此r
每次通过控制蔽光膜的图案(透光与不透光)决定哪些区域应被活化r
以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的r
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该方法的主要优点是可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列r
例如r
合成48(65536)个探针的8聚体寡核苷酸序列仅需4×832步操作r
8小时就可以完成r
而如果用传统方法合成然后点样r
那么工作量的巨大将是不可思议的r
同时r
用该方法合成的探针阵列密度可高达到106cm2r
不过r
尽管该方法看来比较简单r
实际上并非如此r
主要原因是r
合成反应每步产率比较低r
不到95r
而通常固相合成反应每步的产率在99以上r
因此r
探针的长度受到了限制r
而且由于每步去保护不很彻底r
致使杂交信号比较模糊r
信噪比降低r
为此有人将光引导合成技术与半异体工业所用的光敏抗蚀技术相结合r
以酸作为去保护剂r
使每步产率增加到98r
原因是光敏抗蚀剂的解离对照度的依赖是非线性的r
当照度达到特定的阈值以上保护剂就会解离r
所以r
该方法同时也解决了由于蔽光膜透光孔间距离缩小而引起的光衍射问题r
有效地提高了聚合点阵的密度r
另据报导r
利用波长更短的物质波如电子射线去除保护可使点阵密度达到1010cm2r
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