实时荧光定量PCR（RealTimePCR）实验流程一、RNA的提取详见RNA提取及反转录不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为RealTimePCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNaseI进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。二、DNaseI消化样品RNA中的DNA用DNaseI消化DNA组份加量模板RNA10ugRNaseI
hibitor4ulDNaseIbuffer10ulDNaseI10ulDEPC处理H2O至100ul混匀，37℃90mi
三、RNA琼脂糖凝胶电泳1．1的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制：1）称取琼脂糖045g放入三角瓶中，向其中加入45ml的10×MOPS缓冲液和395ml的DEPC水，放微波炉里溶化。2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30mi
。2．取各个RNA样品4l，加入6×RNA电泳上样缓冲液2l混匀，加入变性胶加样孔中。3．120V电压下电泳25mi
。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。四．RNA反转录为cDNA反转录程序以MBI的MMLV为例组份加量20ul体系加量40ul体系模板RNA0125ug根据条带的亮度适当调整3ug根据条带的亮度适当调整引物T1850uM或其他引物20ul40ulDEPC处理H2O至125ul至25ul混匀，70℃5mi
，立即冰浴5buffer40ul80uldNTP10mM20ul40ulRNaseI
hibitor05ul10ul混匀，37℃5mi
MMLV10ul20ul42℃60mi
，70℃10mi
反转录引物的选择与RealTimePCR引物设计的要求
f1）随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难以拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96来源于rRNA。2）OligodT：是一种仅对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3端PolyA尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于PolyARNA只占总RNA的14，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。特别适合检测多个基因的表达，这样可以节约反转录的试剂，cDNA可以多次使用，可用于检测稀有基因是否表达、从极少量细胞中定量检测特定mRNA的表达水平。3）特异性引物：r