1ChIP实验通过与染色质片段共沉淀和PCR技术,在体内检测与特异蛋白质结合的DNA片段。
将处于适当生长时期的活细胞用甲醛交联后将细胞裂解染色体分离并打碎为一定大小的片段200bp1000bp然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与DNA交联的复合物对特定靶蛋白与DNA片段进行富集。采用低pH值条件反交联DNA与蛋白质之间的Schiff键水解释放DNA片段。通过对目标片段的纯化与检测获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。
图2ChIP实验流程
f2RIP实验RIP技术(RNABi
di
gProtei
Immu
oprecipitatio
,RNA结合蛋白免疫沉淀),
是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析;即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白,防止非特异性的RNA的结合,免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来,结合的RNA序列通过microarray(RIPChip),定量RTPCR或高通量测序(RIPSeq)方法来鉴定。是了解转录后调控网络动态过程的有力工具,能帮助我们发现miRNA的调节靶点。
图3RIP实验流程
f3RNApulldow
实验使用体外转录法标记生物素RNA探针,然后与胞浆蛋白提取液孵育,形成RNA蛋
白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合,从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后,通过wester
blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。
图4RNApulldow
实验流程
f4EMSA实验凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSAelectrophoreticmobilityshiftassay)是
一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用、DNA定性和定量分析。生物素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。
图5EMSA实验原理5Luciferase实验
荧光素酶(Luciferase)是自然界中能够产生生物发光的酶的统称,不同的能够控制发光的生物体用不同的荧光素酶来催化不同的发光反应。
萤光生成反应通常分为以下两步:萤光素ATP→萤光素化腺苷酸(luciferylade
ylate)PPi萤光素化腺苷酸O2→氧萤光素AMP光荧光素酶的基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中,将不同类型的细胞(骨髓干细胞、T细胞等)标记上(即表达)荧光素酶,就可以用高敏感度的CCD相机进行对动物体内进行活体观察而不会伤害到动物本身。在荧光素酶中加入正确的萤光素底物就可以放出荧光,而发出的光子可以被光敏感元件,如萤光探测器或改进后的r