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凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)可以:(1)研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用;(2)可用于DNA定性和定量分析;(3)用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
实验方法原理
凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSAelectrophoreticmobilityshiftassay)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA复合物或RNA复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异),和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
f试剂、试剂盒
γ32PATPT4多聚核苷酸激酶NucleaseFreeWaterT4多聚核苷酸激酶缓冲液醋酸铵TE无水乙醇TBEbuffer重蒸水甲叉双丙烯酰胺丙烯酰胺甘油过硫酸铵TEMED(四甲基乙二胺)EMSAGelShift结合缓冲液溴酚蓝
仪器、耗材
水浴锅PCR仪离心机电泳仪电泳槽
实验步骤
一、探针的标记1如下设置探针标记的反应体系:
(1)待标记探针175pmol微升:2微升。(2)T4Poly
ucleotideKi
aseBuffer10X:1微升。(3)NucleaseFreeWater:5微升。(4)γ32PATP3000Cimmolat10mCiml:1微升。(5)T4Poly
ucleotideKi
ase510u微升:1微升。
f(6)总体积10微升(7)按照上述反应体系依次加入各种试剂,加入同位素后,Vortex混匀,再加入T4Poly
ucleotideKi
ase,混匀。23使用水浴或PCR仪,37℃反应10分钟。加入1微升探针标记终止液,混匀,终止探针标记反应。
4再加入89微升TE,混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30以上,即总放射性的30以上标记到了探针上。为实验简便起见,通常不必测定探针的标记效率。5标记好的探针最好立即使用,最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在20℃。二、探针的纯化通常为实验简便起见,可以r
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