全球旧事资料 分类
PCR常见问题分析及对策无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性问题1:无扩增产物现象:正对照有条带,而样品则无原因1模板含有抑制物,含量低对样品不合适3引物设计不当或者发生降解4反应条件:退火温度太高,延伸时间太短对策1纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2更换Buffer或调整浓度3重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物4降低退火温度、延长延伸时间
f问题2:非特异性扩增现象:条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因:1引物特异性差2模板或引物浓度过高3酶量过多浓度偏高5退火温度偏低6循环次数过多对策:1重新设计引物或者使用巢式PCR
f2适当降低模板或引物浓度3适当减少酶量4降低镁离子浓度5适当提高退火温度或使用二阶段温度法6减少循环次数
问题3:拖尾
3退火温度偏低4酶量过多、Mg2浓度偏高6循环次数过多
现象:产物在凝胶上呈Smear状态。原因:1模板不纯不合适
f对策:1纯化模板2更换Buffer3适当提高退火温度4适量用酶5适当降低dNTP和镁离子的浓度6减少循环次数
问题4:假阳性现象:空白对照出现目的扩增产物原因:靶序列或扩增产物的交污染对策:1操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外;
f2除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。3各种试剂最好先进行分装,然后低温贮存PCR产物的电泳检测时间
一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性,不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,
③酶的质量及,④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改。
f酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条r
好听全球资料 返回顶部