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f图21冷冻透射电镜及冷冻电镜下高分辨病毒的三维重构图222冷冻扫描电子显微镜
扫描电镜工作者都面临着一个不能回避的事实，就是所有生命科学以及许多材料科学的样品都含有液体成分。很多动植物组织的含水量达到98，这是扫描电镜工作者最难对付的样品问题。
冷冻扫描电镜（CryoSEM）技术是克服样品含水问题的一个快速、可靠和有效的方法。这种技术还被广泛地用于观察一些“困难”样品，如那些对电子束敏感的具有不稳定性的样品。各种高压模式如VP、LV和ESEM的出现，已允许扫描电镜观察未经冷冻和干燥的样品。但是，冷冻扫描电镜仍然是防止样品丢失水分的最有效方法，它能应用于任何真空状态，包括装于SEM的Peltier台以及向样品室内冲以水汽的装置。冷冻扫描电镜还有一些其他优点，如具有冷冻断裂的能力以及可以通过控制样品升华刻蚀来选择性地去除表面水分（冰）等。冷冻电镜基本的观测流程如下图22所示：
图22低温扫描电镜样品制备及观测流程
f223冷冻蚀刻电子显微镜冷冻蚀刻（Freezeetchi
g）电镜技术是从50年代开始发展起来的一种将断裂和复型相
结合的制备透射电镜样品技术，亦称冷冻断裂（Freezefracture）或冷冻复型（Freezereplica），用于细胞生物学等领域的显微结构研究。
冷冻蚀刻电镜的优点：①样品通过冷冻，可使其微细结构接近于活体状态；②样品经冷冻断裂蚀刻后，能够观察到不同劈裂面的微细结构，进而可研究细胞内的膜性结构及内含物结构；③冷冻蚀刻的样品，经铂、碳喷镀而制备的复型膜，具有很强的立体感且能耐受电子束轰击和长期保存。
缺点：冷冻也可造成样品的人为损伤；断裂面多产生在样品结构最脆弱的部位，无法有目的地选择。
目前，冷冻蚀刻装置的型号很多，但主要分为两种类型：一种是专用冷冻蚀刻装置，如EIKO公司生产的FD2A型、FD3型，BALZERS公司生产的BAF300型；另一种是真空喷镀仪的冷冻蚀刻附件，如日立公司生产的HFZ1型，它与FE1型加温蚀刻装置一起安装在HUS5型真空喷镀仪中使用。以上两种类型各有优缺点，专用装置优点在于操作方便，能连续制样，效率高。缺点是价格贵；附件装置价格虽便宜，但不能连续操作，效率低。利用冷冻蚀刻电镜技术观察到的红细胞如图23所示。
图23红细胞冷冻电镜蚀刻图
3冷冻电镜原理
冷冻电子显微学解析生物大分子及细胞结构的核心是透射电子显微镜成像，其基本过程包括样品制备、透射电子显微镜成像、图像处理及结构解析等几个基本步骤（图31）。在透射电子显微镜成像中，电r