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板(梳子),有机玻璃内槽,水平仪,取液器,微波炉,凝胶成像系统。
3实验试剂:
(1)质粒的提取aLB培养液胰蛋白胨(Trypto
e)10g,酵母提取物(Yeastextract)5g,NaCl5g,琼脂(固体培养基)15g,用1NNaOH调pH75b溶液Ⅰ,溶液Ⅱ,溶液Ⅲ;c氨苄青霉素50mgmL;d抽提液(饱和酚:氯仿:异戊醇25241)作用:氯仿可使蛋白质变性,有助于液相与有机相的分离。平衡酚密度大,可是DNA在上清中。异戊醇防止抽提液起泡。e无水乙醇作用:除去DNA水化层,使DNA沉淀。f70乙醇作用:纯化质粒DNA。gTE缓冲液或ddH2O作用:溶解DNA
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f四川大学实验报告
(2)DNA琼脂糖凝胶电泳检测
aGoldview(DNA染料)
b1×TAE缓冲液
c上样缓冲液(6×)
四.实验方法及步骤
1质粒DNA的提取
a将带有质粒pUC18的大肠杆菌接种在液体培养基中(加氨苄青霉素50μgmL),370C培养过夜;
b取培养菌液15mL置Eppe
dorf小管中,10000rpm×2mi
,弃上清液;
c加入100μL溶液I,漩涡器上充分混匀,在室温下放置10mi
;d加入200μL新配制的溶液Ⅱ,轻轻翻转23次,使之混匀,冰
上放置5mi
;e加入150μL冰冷的溶液Ⅲ,盖紧后,温和颠倒35次使混匀,
产生白色絮状物,冰上放置15mi
;f10000rpm×5mi
,取上清液于另一干净的离心管中;g向上清液中加入等体积(约400μL)酚:氯仿异戊醇(25:241,
vv),振荡混匀,10000rpm×10mi
,将上清液转移至新的离心管中;
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f四川大学实验报告
h加入等体积(约370μL)氯仿异戊醇(241),混匀,10000rpm×2mi
取上清液于新离心管中;
i向上清液加入2倍体积无水乙醇,混匀,200C放置1h;j12000rpm×5mi
,倒去上清液,吸干液体;k加800μL70乙醇,离心12000rpm×1mi
,倒尽上清液,吸
水纸吸干液体,室温自然干燥30mi
,直至变得透明无乙醇味;l加20μLddH2O,混匀使DNA溶解完全,取5μL做电泳检测,
剩余的溶液放置200C保存备用。2DNA琼脂糖凝胶电泳检测a琼脂糖凝胶板的制备b称取03g琼脂糖,置于锥形瓶中,加入30mL1×TAE缓冲液,微
波炉加热直至琼脂糖溶解c待胶液冷却到650C(不烫手为宜),加入1μLGoldview混匀,
搅拌器上搅拌排除气泡,缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽(插入样品槽模板梳子)内静置30mi
左右,轻轻晃动拔出梳子3加样
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f四川大学实验报告
胶板放入电泳槽中(样品孔位于负极),注入1×TAE缓冲液淹没过胶板5mm,用取液器将提取的质粒DNA5μL与1μL上样缓冲液(6×)混匀,加入胶板的样品小槽内。4电泳将电泳槽与电泳仪接通,r
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