实验四植物基因组DNA的提取
实验目的通过本实验学习从植物组织中提取DNA的方法。实验原理利用液氮对植物组织进行研磨,从而破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜,使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白,得到的DNA溶液经乙醇沉淀。实验材料新鲜植物叶片【仪器、材料与试剂】(-)仪器1.低温离心机2.恒温水浴器3.台式离心机4.紫外分光光度计5液氮灌(二)材料l。三羟甲基氨基甲烷(Tris)2.乙二胺四乙酸(EDTA)3.氯化钠(NaCl)4.β巯基乙醇5.氯化钾(KCI)6.异丙醇7.乙醇8.陶瓷研钵9.吸头、小指管(三)试剂(三)试剂1.细胞提取液100mmol/LpH
f5mmol/LEDTApH
500mmol/LNaCl
%
SDS
1mol/Lβ巯基乙醇
2.5mol/LKCI
3,TE(见实验二质粒DNA的提取及酶切)
实验步骤
1取4g新鲜叶片,在液氮中研磨成粉末状(越细越好)。
2转移至50ml离心管中,加入16mlTENbf,充分混匀。65℃水浴保温20mi
。
3从水浴中取出离心管,加入5ml5molLKCl溶液,混匀,水浴20mi
。
44000rmi
离心20mi
。
5将上清液转移到另一50ml离心管中。
6加等体积酚/氯仿混匀,12000r/mi
离心5mi
,取上清。
7加等体积氯仿,混匀,12000r/mi
离心5mi
,取上清。
8加入-1倍体积的异丙醇(沉淀DNA),混匀。放置时间
9离心获得沉淀,70%乙醇洗3次。风干沉淀。
10加入3mlTE缓冲液,溶解DNA。
11取3mlDNA溶液测定DNA在260
m和280
m的OD值,并分析DNA的纯度
和含量
实验结果
注意事项
1尽量取材幼嫩叶片,如太老,酚类物质多,必须用10mM的βME处理。
叶片磨得越细越好。
2移液器的使用。
3由于植物细胞中含有大量的DNA酶,因此,除在抽提液中加入EDTA抑制酶
的活性外,第一步的操作应迅速,以免组织解冻,导致细胞裂解,释放出DNA
酶,使DNA降解。
f4研钵预冻,粉末至加CTAB前不要融化。5氯仿异戊醇抽提时动作应轻柔。6所用试剂必需灭菌。
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