M15006巯鸟嘌呤
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U266AR
人骨髓瘤U2668氮鸟嘌呤
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骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20，细胞浓度以104～5×105ml为宜，最大浓度不得超过106ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1：3～1：10的比例传代。每3～5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。
（2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，
加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾
脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞孔。
2．细胞融合的步骤（1）制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALBC小鼠，6～10周↓
拉颈处死，浸泡在75酒精内，3～5mi
↓
用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜
↓
用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管）↓
反复冲洗，吸出冲洗液
↓
冲洗液放入10ml离心管，1200rpm分离5～6mi

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mbthwi±cyxfzP23dqFG
f↓
用20小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105ml
↓
加入96孔板，100μl孔
↓
放入37。cCO2孵箱培养
（2）制备免疫脾细胞
最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死
↓
无菌取脾脏，培养液洗一次
↓
脾脏研碎，过不锈钢筛网
↓
离心，细胞用培养液洗2次
↓
计数
↓
取108脾淋巴细胞悬液备用
（3）制备骨髓瘤细胞
取对数生长骨髓瘤细胞离心
↓
用无血清培养液洗2次
↓
计数，取得×107细胞备用
（4）融合
①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无
血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm8mi
弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响
聚乙二醇（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。
②90s内加入37℃预温的1ml45PEG（分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。37℃水
浴作用90s。
③加37。C预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2mi
分别加入1ml、2ml、3ml、
4ml、5ml和6ml。
④离心，800rpm6mi
。
⑤充上清，用含20小牛血清HAT选择培养液重悬。
⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层r