装填颗粒尺寸分布曲线的最小粒径时，有些填料能穿过这些缝隙而流出色谱柱，这样会导致空白出现。如果柱子有箭头标志建议的流动方向，我建议通过操作手册和说明书，厂家主页或者技术支持部门等确认是否可以把柱子反过来冲。无论你是否把柱子反方向，最好不要让溶剂通过检测器避免污染物和穿透缝隙的颗粒进入检测池，否则有可能引起污染。
清洗柱子频率主要看有多少强保留物质被打入色谱柱。因为反相柱有时候在分辨率消失或者鬼峰出现前能承受很大的污染，使用者经常会等到出现了异常情况才开始注意。然而，污染物过多的累积会导致清洗柱子的难度加大。所以，如果你知道经常用杂质较多的样品上样时，我建议你们有规律地清洗柱子，你越是频繁清洗柱子，就清洗起来就越不费劲。33清洗硅胶键合反相柱的蛋白质残余
如果是生物物质如血浆或血清等积累在反相色谱柱上，操作者必须采用不同的清洗程序。大部分情况下，纯有机溶剂如乙晴或甲醇不溶解多肽和蛋白质因此不能有效地清洗柱子。然而，有机溶剂和缓冲液、酸、离子对试剂等的混合物则能有效地溶解。一开始，先开始尝试用百分比含量高的高强度溶剂（溶剂B）冲洗一体积。Freiser和他的合作者发现重复变化三氟乙酸水溶液和三氟乙酸－丙醇之间梯度的高低可以再生被污染的反相柱子。Bhadwaj和Day认为在250mm×46mm的柱子中注入100μL的三氟乙醇就能起到效果。如果上述几个方法都不成功，Cu
ico和他的同事推荐了几种强溶剂和增溶剂来除去蛋白质（见表三）。在使用这些溶剂之前，可以先咨询柱子的厂商确保这些溶剂能与柱子的填料相容。硅胶基质的柱子通常来说都是相容的，但有机聚合物基质的柱子可能会在某些溶剂组合中膨胀或收缩，这样会影响其色谱行为。
当用前述的溶剂系列时，确保表三所提到的溶剂能与系列中的溶剂互混。对每个溶剂系统至少要冲洗20体积。由于有些溶剂系统黏性很大，冲洗的流速应该相应调整以确保不会超过泵压。用完胍或尿等溶剂侯，至少应该用40～50体积的HPLC级水来冲洗柱子。
对于反相柱子，不建议用表面活性剂如十二烷基磺酸钠（SDS）和三硝基甲苯，因为这些化合物必然会牢固吸附在硅胶键合相柱子上很难除去。用表面活性剂会影响装填表面而改变其性质。然而有一个分离小组的研究表明由某个小组做的污染后的柱子可以用500μL1％SDS溶液用1mlmi
的流速清除下多肽合成产物。如果继续用从5％～95％含1％（vv）三氟乙酸的乙晴梯度洗脱，可以恢复多肽的分离。
34清洗反相柱的特殊技巧
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