4转染:把AB复合物缓缓加入培养液中,摇匀,37℃温箱置624小时,吸除无血清转染液,换入正常培养液继续培养。
5其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。注意:转染时切勿加血清,血清对转染效率有很大影响。
2、快速脂质体转染法操作步骤如下方法二:
1以5×105细胞孔接种6孔板或35mm培养皿培养24小时,使其达到5060板底面积。
2在试管中配制DNA脂质体复合物方法如下:①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2
eo质粒DNA或供体DNA。②旋转1秒钟,再加入脂质体悬液,旋转。③室温下放置510分钟,使DNA结合在脂质体上。3弃去细胞中的旧液,用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去,向每孔中直接加入1mLDNA脂质体复合物,37℃培养35小时。4再于每孔中加入20FCS的DMEM,继续培养1424小时,5吸出DMEMDNA脂质体混合物加入新鲜10FCS的DMEM,2mL孔,再培养2448小时。6用细胞刮或消化法收集细胞,以备分析鉴定。
3、稳定的脂质体转染方法如下:
1接种细胞同前,细胞长至50板底面积可用于转染。2DNA脂质体复合物制备转染细胞同前2、3步骤。3在每孔中加入1mL、20FCS的DMEM,37℃培养48小时。4吸出DMEM,用G418选择培养液稀释细胞,使细胞生长一定时间,筛选转染克隆,方法参照细胞克隆筛选法进行。三、个人经验:1、转染前1天将05~2×105细胞接种于24孔培养板,并加入500ul不含抗生素的完全培养基,以保证转染时细胞汇合达90~95。2、准备复合物1将08ugDNA稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中轻轻浑匀。2将2ulLipofectami
e2000稀释于50ul无血清无抗生素的培养液中,轻轻浑匀,室温孵育5分。注意:必须在25分内进行。35分后将它们混合,并轻轻浑匀,室温孵育20分。3、吸去培养板的培养基,用PBS或无血清培养基最好清洗细胞2次。4、将复合物总体积100ul加入培养孔,前后摇动培养板使其分布均匀。5、将细胞放入培养箱孵育4~6h后,可以更换含血清培养液去除复合物也可不用。6、24~48h后可以观察转入基因表达情况。
f7、稳定转染:换含血清培养基24h后将细胞以1:10或更高比例传代,1天后更换筛选培养基筛选。
8、优化:要保证细胞汇合率达90~95比较高DNALipofectami
e2000比率1:05~1:5,一般细胞1:2~3
脂质体转染法的主要优点是可用将DNA转染至悬浮或者铁壁细胞培养、转染效率相对较高、对基因片段大小的限制较小等,但是
阳离子脂质体对细胞的毒性相对较高,为了防止其毒性,要摸索好如下实验条件:脂质体与质粒的比例r